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CEInfinite: 全柱成像新技术拓展蛋白质分析无限想象空间

2013.7.26

　　【导语】用液相色谱法分离分析多肽或一些小蛋白的方法已经很成熟，但若要分析较大的蛋白质分子，科学和工业界都会选择电泳技术，比如在生物制药行业中做提纯后蛋白质的分析表征。不过，不管是凝胶电泳还是传统的毛细管等电聚焦，电泳实验可真不是好做的，方法开发困难、实验时间长、重现性差、操作复杂、线性范围窄等等一系列问题，让实验者头痛不已。从上世纪90年代末开始至今，很多国内外文献都报道了一种全柱成像毛细管等电聚焦技术，可以突破以上电泳技术的种种极限，并给予蛋白质分析实验者各种应用和想象的空间。加拿大AES公司推出的CEInfinite型全柱成像毛细管等电聚焦电泳仪（cIEF-WCID），正是这种新技术的成功商品化应用。近日，小编有幸采访到AES公司的总裁兼CEO黄铁民博士和北京绿绵科技有限公司欧阳伟民总经理，他们将为我们详解CEInfinite在蛋白质分析中的应用，希望对所有关注蛋白质分析的研究者有所帮助……

AES公司总裁兼CEO黄铁民博士（左）与北京绿绵科技有限公司欧阳伟民总经理（右）合影

CEInfinite 全柱成像毛细管等电聚焦电泳仪（cIEF-WCID）

全柱成像毛细管等电聚焦电泳仪（cIEF-WCID）：

不移动已聚焦固定的蛋白质区带，直接“拍照”检测

　　谈到cIEF-WCID的定义，先得谈谈IEF和cIEF的由来。

　　名词解释：

　　IEF：等电聚焦电泳，iso-electric focusing electrophoresis

　　CE：毛细管电泳，capillary electrophoresis

　　cIEF：毛细管等电聚焦电泳，capillary iso-electric focusing electrophoresis

　　cIEF-WCID：全柱成像毛细管等电聚焦电泳，capillary iso-electric focusing electrophoresis -whole column imaging detection）

　　等电聚焦电泳IEF技术是表征蛋白质及其他生物高分子的一种主要方法。在生物制药行业，IEF是一种有30年历史的常规方法，用于生产过程分析、药物制剂研究分析及最终产品的质量控制分析，最早是用凝胶IEF实现。然而，作为一种重要的蛋白质分析方法，凝胶IEF分析基本上是非自动化的手工操作，分析速度慢、只能半定量。早在70年代末80年代初大家就认识到，如果IEF技术能转移到分离柱里进行操作，它的分析速度、自动化程度及定量分析的能力就会大大地提高。毛细管为分离柱的IEF方法即毛细管等电聚焦cIEF在1985年被首次报导。它是将带有两性基团的样品、载体两性电解质、缓冲剂和辅助添加剂的混合物注入毛细管内，当在毛细管两端加上直流电压时，载体两性电解质可以在管内形成一定范围的pI梯度，样品组分依据其所带电性向阴极或阳极泳动，柱内pI值与该组分的等电点（pI）相同时，溶质分子的净电荷为零，宏观上该组分将聚集在该点不再进一步迁移，达到使复杂样品中各组分分离的目的。

　　过去，cIEF方法是用商品通用毛细电泳CE(capillary electrophoresis)仪器来完成的，我们称之为传统单点检测cIEF。起初人们对这种传统cIEF报有很大希望：因为使用分离柱操作IEF，将会减少样品用量，大大提高分析速度，实现自动化及定量。科学界内期望cIEF被长期使用凝胶IEF技术的分析人员所接受，进而在生物制药行业内代替凝胶IEF技术。但是，这些期望没有实现。究其原因，主要是用通用CE仪器来做传统单点检测cIEF方法有很多不可克服的困难。

　　传统单点检测cIEF的主要问题是移动过程(mobilization process)。在IEF聚焦过程结束时，各蛋白质组份都已在毛细管内形成不移动的窄区段。但由于通用CE仪器的检测器都是单点检测器，用这种仪器去检测那些不动的蛋白质区段就要有一个移动的过程——把这些已经聚焦好、固定好的蛋白质区段，再推到单点检测器的检测点。传统单点检测cIEF技术的困难与麻烦都是来自这个移动过程。凝胶IEF虽然没有这个过程，但产生的最大问题是分辨率差，方法优化麻烦，分离时间长及重现性不好。

　　那么，是否可以开发一种既利用了毛细管等电聚焦电泳高速、高分离度的特点，又能直接检测已固定聚焦好的蛋白区段的技术？

　　这时，人们会想到“照相”，透过毛细管，对这些聚焦好的区段直接拍照不就行了？

　　不过，真正设计成仪器，就得考虑透过毛细管拍照的速度、灵敏度、线性范围、实际操控的方便性、稳定重现性等等一系列问题。

　　终于，CEInfinite型全柱成像毛细管等电聚焦电泳仪cIEF-WCID（whole column imaging detection）横空出世，它是电荷耦合装置 (CCD) 成像技术和微分离技术发展到一定高度后的产物，CEInfinite利用更为先进的CMOS成像技术对整个微分离通道（长度通常为3-8厘米）内的分离进行成像检测，检测信号可以是紫外吸收、折射指数梯度或激光诱导荧光。

单点检测毛细管电泳原理图：将待分析溶液引入毛细管进样一端，施加直流电压后，各组分流向毛细管出口端，按阳离子、中性粒子和阴离子及其电荷大小的顺序通过检测器。依据迁移时间确定样品，利用朗伯-比尔定律对样品进行定量。但是普通毛细管电泳分离能力较弱、分析时间长、对PH值要求高，且重现性差。

全柱成像毛细管电泳技术的原理图：在高压下，样品通过具有涂层柱的毛细管，根据蛋白质pl点的不同在毛细管内聚焦，CMOS照相机可以直接检测不同蛋白质的pl点。撤掉电压后，样品峰经过扩散，利用朗伯-比尔定律可对样品进行定量，并可进行分子量测量、或对分子间相互作用进行研究。

CEInfinite型cIEF-WCID和传统单点检测cIEF、凝胶IEF的比较

分析速度：远远超过其它技术

　　在蛋白质pI点测定这个最核心的传统项目上，CEInfinite cIEF-WCID（全柱成像毛细管等电聚焦电泳仪）耗时小于10分钟，传统单点检测cIEF 45分钟，凝胶IEF 400分钟。

cIEF-WCID （红色）；传统单点检测cIEF（cIEF，绿色）和凝胶等电聚焦（Gel IEF，兰色）的分析时间比较

全面比较：CEInfinite处处领先

	凝胶IEF	传统单点检测cIEF	CEInfinite cIEF-WCID
实验难度	高	低	低
自动化	不行	可以	可以
pI测定和峰鉴定	不准确	准确	准确
定量	不行	可以	可以
分辨率	很差	较好	极佳
重复性	很差	还可以	非常好
pI范围	窄	宽	非常宽
方法运行时间	非常长 400分钟	长 45分钟	短, 小于10分钟
方法开发时间	非常长	长	短

　　从上表可见，CEInfinite型全柱成像毛细管等电聚焦电泳仪（cIEF-WCID）在分析通量、分辨率和重复性等方面均占突出的优势，非常适合蛋白质分析的基础研究、工业化标准和法规检测。对于基础研究，它大大节省了科研工作者方法开发的时间和精力成本，助力科研工作者做出更漂亮的工作。对于生物制药等工业化领域，它带来的直接好处就是增加效益、降低成本。对于法规检测机构，它大大降低了对实验人员的技术要求，便于方法的普及推广和真正贯彻实施。

与传统单点检测cIEF的技术细节比较

　　原理上，两者的区别很大；在实际的技术细节上，CEInfinite也显示出强大的优势。

参数	传统单点检测cIEF	CEInfinite	CEInfinite的优势
分离柱内径	小于75微米	100-250微米	光程更长，灵敏度更高
电压	高于2万伏	低于0.5万伏	操控更简单、更安全
柱长	长于40厘米	3-5厘米	分析时间更快
是否需要电渗流	需要电渗流	不需要电渗流	操控更简单
是否需要多次清洗	需要多次清洗	不需要多次清洗	操控更简单
方法的建立	建立方法困难	建立方法非常容易	对研究和检测都更有利
线性范围	线性范围窄	线性范围宽	更适于定量
重复性	重复性差	重复性媲美HPLC	更适于定量

与凝胶IEF比较——更快、更省、更人性化

　　黄博士表示：“凝胶电泳是最传统的技术，需要的分离时间长，需要大量的人力物力，也需要消耗大量的消耗品，它的结果只能是半定量，不能完全定量，而且不能实现自动化。而CEInifinite全柱成像毛细管等电聚焦电泳保持了凝胶电泳直观和高分辨率；具有快速，自动，定量的特征；方法建立简单，重复性好，检测线性范围宽；还具有成像检测独有的多参数分析。”

　　“目前，我们已利用微流控技术，将CEInfinite和质谱联用。可以摆脱传统双向凝胶电泳和质谱分析技术在离线分离分析方面的种种困扰，并解决传统单点聚焦CE-MS联用的种种历史遗留问题，大大推动蛋白质组学、生物医药研发等领域的发展。”黄博士兴奋地表示。

CE-WCID的技术优势

CMOS照相机——检测整个分离通道内的各组分的动态变化

　　CEInfinite采用照相机CMOS(Complementary Metal-Oxide-Semiconductor Translator，互补性金属氧化物半导体)作为成像检测技术，代替了传统的CCD成像技术，具有高速数据采集、宽线性范围、绿色节能、超高检测灵敏度和和仪器稳定性等优势，这是其成为蛋白质分析的黄金技术和工业标准的重要基础。

　　拥有最全的pI标记物和CEInfinite两性pH载体

　　所谓好马配好鞍，做好cIEF-WCID全柱成像毛细管等电聚焦电泳实验，除了好仪器，还要有好配套。和CEInfinite系统配套的是：

　　（1）目前世界上最全的pI标记物(pI Marker)：30种pI Marker(pI点范围：2.8 ~11)；相当于给CEInfinite提供了准确的刻度尺，保证每次实验的准确、精确。

　　（2）最完善的pH载体(carrier ampholytes)：四种ZL化独有的Aeslytes pH 3-10、Aeslytes pH 2.5-5、Aeslytes pH 5-8 和Aeslytes pH 8-10.5，并可以根据客户需要定制高分辨的pH范围。相当于提供了4种量程，大大方便实验的操作、提高分析速度和质量。