反相C18液相色谱柱选择性理论及其应用
反相C18液相色谱柱选择性理论及其应用
摘要: 反相HPLC分析中色谱柱的选择性受到了越来越多的关注, 在这些色谱柱中, C18 柱是目前最常用的色谱柱, 然而各种C18 色谱柱在分离效果上也存在着较大差异, 因此能否找到合适的C18 柱关系到整个实验的成败。经过近年来的研究, 已形成了一些色谱柱分类、选择方法, 如色谱柱参数 (H, S, A, B, C) 法、相似系数 (F值) 法等, 减少了色谱柱选择的盲目性。本文结合近年来的研究, 归纳了这些方法的优点及其在应用过程中的局限性, 并基于前人的理论, 结合实际工作, 为药品分析中合理选择色谱柱提出了建议和方法。
高效液相色谱法 (HPLC) 作为各国药典收录的常规分析方法以其高效、灵敏和选择性好等特点广泛用于药物原料及其制剂的含量和杂质分析。在实际工作中, 对高效液相色谱法, 尤其是反相高效液相色谱法来说, 色谱柱的选择是一项十分重要的工作, 能否找到合适的色谱柱, 关系到整个分析工作的成败。C18柱是目前最常用的色谱柱, 市场上有600 多种C18 色谱柱, 且不断有新的色谱柱出现。采用不同的色谱柱分析具体样品时, 由于色谱柱选择性的差异, 溶质的保留值、色谱峰之间的分离度甚至色谱峰顺序都可能出现较大的差异[1, 2]。各国药典目前仅给出C18 色谱柱的简单信息, 如中国药典中的“用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂”; 美国药典 (USP) 中的“L1 填
料 (octadecylsilane bonded silica gel)”等未对C18 色谱柱的具体型号等进行规定和推荐。欧洲药典 (EP) 中虽然有时还给出色谱柱孔径、颗粒大小、比表面积等信息, 但这些物理参数与色谱柱的选择性之间也仅有中度关联或缺乏关联[3]。因此, 在实际工作中选择色谱柱时存在一定的盲目性, 也给药典方法的执行带来一定难度。在新药研发过程中建立HPLC 分析方法时, 虽然从药物的相对分子质量及pKa 入手, 已经有一些经验性的色谱柱选择方法可以参考[4−6], 但在针对难分离物质对时, 仍需要经过对色谱柱和流动相的大量筛选才能完成。
目前对色谱柱的性能测试主要有非色谱法 (nonchromatographic methods) 和色谱法 (chromatographicmethods) 两类: 非色谱法采用红外光谱和核磁分析等直接分析色谱柱填料的特征; 而色谱法则致力于通过将色谱柱对溶质保留值的影响量化, 以期直观地反映色谱柱的性能差异。色谱法又可分为经验法(empirical based evaluation method)、热动力学法(thermodynamically based methods) 和保留机制法(evaluation method based on a retention model)[7, 8], 其中保留机制法已成为近年来的研究热点。本文主要对基于保留机制法的反相色谱柱选择理论及其应用的进展情况进行介绍。
