ACE HILIC色谱柱方法开发指南Ⅱ - HILIC的分离机制
HILIC分离机制
HILIC是一种复杂的分离技术，通过多种相互作用模式来实现保留。
这些相互作用的权重（中哪种是主要作用）是基于固定相、流动相和分析物的理化特性。
为了得到可靠和稳健的HILIC方法，了解潜在的不同相互作用（了解可能存在的不同相互作用）是很有帮助的。
这样可以为待进行的方法开发合理选择色谱柱和条件。（这样可以为方法开发的色谱柱和条件做出合理的选择）
HILIC中的流动相通常包含大量的乙腈（>70%）以及至少3%的水。
水性组分使得极性固定相周围存在亲水环境，并且形成吸附水层以便分析物分散（分配）。
主要的HILIC保留机制包括：
分析物分散（分配）到吸附水层，各种极性相互作用和静电（即离子交换式）相互作用（参见图3）。
如果将极性分析物通入（极性分析物进入）HILIC环境中，则可使用这些保留机制中的任意一种（则物质的保留可能是任何一种机制作用，也可能是所有机制同时作用）。
图3
潜在HILIC保留机制图示
极性分析物通常包含能够与其它极性基团相互作用的各种基团，如：固定相上的基团。极性相互作用包括氢键和偶极-偶极与其它基团的相互作用。带
电分析物也可以进行静电或离子交换式相互作用，其中分析物可以被固定相吸引或排斥。
例如，一个带负电的或酸性的分析物会被带负电的（即酸性的）固定相排斥。
但是，带正电的或碱性的分析物可被带负电的（酸性的）固定相保留，反之亦然。
ACE HILIC色谱柱固定相：
过去，许多HILIC固定相都采用非键合硅胶。
这些酸性相提供了必要的相（固定相必要的）极性，以在（使其能）HILIC模式中与高有机物含量洗脱剂很好地相互作用。
非键合硅胶相很有（好）用，所以仍在广泛使用。
最近，在市场上已经可以买到专门用于HILIC环境的各种键合相（固定相）。
这些新的极性键合相根据相（固定相的）特性可分为很多种，包括酸性的、碱性的、中性的和新型的化学相。
ACE HILIC组合目前包括酸性的、中性的和碱性的固定相。
这些相已被证实可相互提供不同的选择性。
这些（三款）ACE相（固定相）彼此提供了替代选择性，可参见图4.九种组分混合物中的中性和带电分析物，在相同条件下，对三种不同的ACE HILIC相（在三款不同固定相的ACE HILIC色谱柱上）显现出不同的保留和洗脱顺序。
这清楚地表明：HILIC模式下各ACE HILIC固定相之间存在选择性差异，使得这三种色谱柱成为HILIC方法开发的理想选择。
图4
ACE HILIC固定相范围内洗脱顺序的对比
色谱柱：150 x 4.6 mm, 5 μm
流动相：10 mM甲酸铵，pH4.7（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）
流速：1.5 mL/min
温度：25 °C
检测：UV, 254 nm
样品：
1) 对氨基苯甲酸
2) 4-羟基苯甲酸
3) 烟酰胺
4) 醋丁洛尔
5) 腺嘌呤
6) 扁桃酸
7) 酪胺
8) 阿替洛尔
9) 2’-脱氧鸟苷
ACE HILIC-A相
ACE HILIC-A相能形成负电荷，并显示出高（强）阳离子交换能力。
带电的碱基（碱性物质）对ACE HILIC-A相进行（产生）静电吸引，而带电的酸性物质则被排斥。
ACE HILIC-A相的带电程度取决于流动相的pH值。
ACE HILIC范围的推荐pH限值为pH2.0到pH7.0。
通过增大pH值，固定相上的负电荷将变得更明显，从而保留更多的阳离子分析物。
ACE HILIC-N相
中性ACE HILIC-N相对阴阳离子都显示出较低的离子交换能力。
ACE HILIC-N相的保留机制包括极性相互作用、吸附和一定程度的分散（分配能力）。
ACE HILIC-B相
ACE HILIC-B相具有合理的阴离子交换能力，从而可保留酸性分析物，同时碱性分析物将被排斥。
与ACE HILIC-A相似，pH值可影响固定相的电荷，因此可减弱或增强该相的正特性（该相的正电荷特性）。
