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交联聚乙烯基吡咯烷酮快速前处理方法结合液-...(二)

2020.5.18

图2 展示了10 mg/ L 酪蛋白酶解产物SRM 扫描的总离子流图与提取离子流图。结果表明,所选择的肽段保留时间分布合理、利于区分; 所选择的离子对信号强度、信噪比良好。需要指出的是,α-酪蛋白标准品为α-S1 与α-S2 的混合物,其中α-S1 约占80%,α-S2 仅占20%。因此,10 mg/ L α-酪蛋白中, α-S1和α-S2 实际浓度分别为8 和2 mg/ L 。相比PCR 和ELISA 检测,LC-MS/ MS 不仅能直接对目标过敏原进行鉴定,还可以同时分析不同亚型,方法的选择性、准确度、通量均有很大提高。

 

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图2酪蛋白特征性肽段SRM 总离子流图(TIC)与提取离子流图(XIC)

Fig. 2 SRM total ion chromatogram and extracted ion chromatogram of casein unique peptides

 

3. 2 红葡萄酒快速前处理

利用PVPP 实现了红葡萄酒高效、快速前处理,并最大程度地降低了蛋白的损失。向红酒中加入足量的PVPP 竞争性吸附单宁,再加入过量的Trypsin快速酶解蛋白,离心取上清液,并重复一次,合并两次上清液后直接进行质谱分析(图3)。与传统方法相比,PVPP 法不仅使回收率明显提高,也使前处理时间由12 h(过夜酶解)缩短到2 h 之内。

 

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图3PVPP 处理红葡萄酒的原理与流程

Fig. 3Mechanism and workflow of polyvinylpyrrolidone (PVPP) pre-treatment of red wine

 

PVPP 添加量是影响前处理效率和回收率的关键因素。在酪蛋白添加200 μL 1 mg/ L 的红酒基质中,平行加入不同体积的100 mg/ mL PVPP 混悬液,前处理完成后分别进行质谱分析,比较总离子流强度(图4)。结果表明,在PVPP 混悬液加入量为200 μL,即绝对量为20 mg 时,响应最高,由此确定20 mgPVPP/200 μL 红酒为最优添加量。

 

值得注意的是,PVPP 添加量与处理效果并不完全成正比,当超过最优添加量时,质谱响应反而下降,处理效果变差。这可能与PVPP 的比表面积和吸附力有关:达到最优添加量之前,PVPP 在红酒中均匀分散成小颗粒,比表面积大、吸附力强,有利于酚类物质吸附;当添加量超过最优值后,PVPP 颗粒之间快速团聚形成沉淀,吸附能力下降,同时蛋白也随酚类物质掺杂在沉淀中,难以有效释放。因此,合适的PVPP 添加量对前处理非常重要。

 

考察了PVPP 法的基质效应,200 μL 红酒经PVPP 处理并添加酪蛋白(1 mg/ L )后质谱分析,并与等量经PVPP 处理的空白红酒基质进行比较。结果表明(图5),基质对肽段的质谱响应影响不大(峰面积差异小),空白基质未见特征肽段的质谱响应。证明基质效应对检测无影响,前处理方法可靠、有效。

 

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图4PVPP 添加量对红酒中酪蛋白特征肽段SRM 总离子流强度的影响(n =3)

Fig. 4Effect of PVPP addition on total ion chromatogramintensity of casein in red wine (n =3)

 

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图5红酒基质效应考察

Fig. 5Effect of red wine matrix on casein analysis

 

3. 3 多方法的回收率比较

红酒经PVPP 处理后,酪蛋白(1 mg/ L , 1 ppm)回收率达到70%以上(图6)。而同样条件下,传统

方法的回收率很低,丙酮沉淀法回收率为10% ~25%,超滤法回收率低于1%(图6)。丙酮沉淀法与超滤法是蛋白样品前处理的经典方法,但由于红酒中存在大量单宁,抑制了蛋白的提取与酶解。PVPP有效解决了这一难题。

 

表2 PVPP 处理0. 1 mg/ L 红酒酪蛋白的回收率及重现性(n =4)

Table 2Recovery and reproducibility of PVPP method for casein in red wine (n =4)

 

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