（3） 用含体积比0.01%Tween-20的PBS洗6次，以弃去细胞，加入生物素化抗细胞因子的检测抗体，孵育3h。再洗6次后，加入AP或HRP标记的链亲和素，室温孵育3h。 
（4） 用PBS-Tween-20 再洗5次，加入底物 室温下显色，待出现紫色(AKP和底物的产物)或红色(HRP和底物的产物)斑点时，即可用立体解剖显微镜或计算机辅助成像分析系统计算斑点数，并用斑点形成单位(sfu/L百万加入细胞)记录结果。每一个斑点代表一个特异分泌CK的细胞。若预先包被抗原，则可用于ASC测定，这时，每一个斑点代表一个分泌特异抗体的细胞。 
完成了以上步骤后其实只是完成了实验的一半。在你不断摸索反应的条件之后，得到了一块布满斑点的板，接下来要如何对这些斑点进行分析呢。如果利用显微镜人工技术无疑是太参有个人因素的实验了，实验结果肯定会被审稿人好好质疑一番。随后，有人使用数码相机拍摄下来后，使用photoshop进行处理、计数，这种方法也存在较多的个人因素。一项技术要普及，为广大研究人员所接受，就必需尽量减小人为的误差。所以，近年许多公司开始开发计算机辅助系统，使用系统设定的阈值对斑点进行人工智能计数。这样，由计算机将阴性对照中非特异反应斑点进行去除，同时由计算机进行统一计数，这样的实验结果置信度便大大提升了。目前判断的首要标准还是斑点的大小，但是做过电泳、同位素等的计算机成像的研究人员都遇到过一个问题：很多时候实验会产生一些较淡的斑点，用肉眼判断绝对是背景。所以在设计软件时也必需考虑到斑点深浅因素。计算机可以利用斑点的深浅、是否以中心为原点向四周减淡等特征对细胞分泌动力学特征进行分析，这项技术的成熟相信会使ELISPOT的应用范围更加扩宽。 
（5） ELISPOT 斑点的判读像多数的Cell-based分析技术一样，ELISPOT Cytokine技术也是相当耗时、耗劳力的工作。事实上到目前为止，以目视法判读少量细胞族群的特性如激活T细胞之激素分泌，仍被视为是免疫学技术上的一大挑战。ELISPOT结果的判读常需要专聘、有经验的技术员才可以；有时就算有专职技师判读，使用传统的显微镜计算斑点数仍不免会偶有主观意见，而有所偏颇。 
科学实证的本质，在于如何使实验结果能尽可能客观、精确、同时有高重现性，传统的人工计算法显然无法达到此一要求。故而有几个科研团队使自行开发Plate Scanner与自动分析软件，其中以Paul Lehmann教授研究开发之ImmunoSpot Analyzer自动分析仪最具代表性。分析ELISPOT实验数据的过程中，仪器先以高分辨率镜头捕捉微小孔中膜上呈色影像，而后储存成TIF檔；这些影像可以进一步使用手动、或是自动方式计算斑点数目，如果使用ImmuneSpot分析软件，可以先设定条件，然后同时分析斑点的大小，以推估激素分泌的多寡。预料像ImmunoSpot Analyzer这一类自动图像扫描分析仪器，将可克服传统显微镜判读方法耗费人力、及人为客观性等缺点，彻底解除ELISPOT分析技术的瓶颈问题，进一步推广该技术的新颖应用。 
ImmunoSpot@影像扫描分析仪可以提供不同的数据格式，包括未处理与处理过的膜表面影像、每个小孔中的斑点数目、每个小孔中的平均斑点数目、每个小孔中斑点大小的直方统计图。 
ELISPOT分析仪的出现解决了以下问题 
哪些斑点是抗原特异性 T 细胞产生的（此斑点具有进一步分析价值），哪些是无关细胞产生的（此斑点没有 T 细胞研究价值）  
斑点大小的意义 。 
在对不同细胞因子计数和分析时，如何定义斑点最大和最小尺寸。 
如何从单个细胞基础上分析 。 
实验精确度有多高？如果一个细胞产生相似的细胞因子，在多大程度上会干扰分析结果。 
几次重复实验才能使结果更有意义。 

******************************************************************************* 
ELISPOT技术优势及应用 
ELISPOT的历史可以追溯到1963年Jerne等人创立的溶血空斑技术(hemo-lytic plaque forming cell assay，HPF)，这项技术可用于检测并计数单个抗体形成细胞。随着单克隆抗体技术的成熟，1983年，Czerkinsky等采用此法检测脾细胞中分泌特异性抗体的细胞数，发现该方法敏感性高简便易行。后来，他们又用这种方法定量分析受到有丝分裂原刺激的外周血中分泌IFN2γ的细胞数。随后，用ELISPOT法在单细胞水平检测分泌其他细胞因子(如IL-2，IL-4，IL-5，IL-10，TNFα和IL-6) 数量的手段也被建立起来。Nordstrom等用生物素-抗生物素蛋白生物放大法来提高这种方法的敏感性，Herr用计算机辅助图像分析系统(computer-assisted video image analysis，CVIA)自动分析TNF2α酶联免疫斑点的大小和数量，计算与负载抗原肽的靶细胞接触后外周血单核细胞(PBMC)中抗原特异性CD8+T细胞的数量，不但提高了对背景染色的分辨力也使大规模研究成为可能。Vaquerano等将数码相机和计算机结合起来，开发出类似的斑点计数系统，认为当每孔斑点数大于100时，这种方法更客观、可重复性高且节省时间。 
随着ELISPOT技术的不断发展，它的优势也渐渐显示出来，下面将列举ELISPOT对比其它一些传统技术的优势所在。