动物骨髓细胞染色体的制备与观察-1

[实验目的]

1. 通过青蛙或小白鼠骨髓细胞染色体的制备，初步掌握低渗法制备动物骨髓细胞染色体的方法。

2. 熟悉染色体的形态、种类及青蛙、小白鼠等动物染色体的数目或类别。

[实验原理]

骨髓细胞是具有旺盛分裂能力的细胞，从这些分裂细胞中，可观察到处于分裂中期的染色体，能对一种动物染色体的形态特征、数目进行准确的观察和分析。由于骨髓直接涂片观察到的分裂相少，效果差，因此要对骨髓细胞进行必要的处理。这个处理方法称为低渗法，其基本要求首先是要获得较多的中期分裂相。秋水仙素对分裂期纺锤丝的形成具有破坏作用，当动物被注射适量的秋水仙素后，处于分裂增殖中的骨髓细胞由于纺锤丝不能形成，中期染色体不能正常趋向两极，到达后期、末期，因而大量的细胞处于观察染色体形态最佳的分裂中期。其次是要能够清楚的观察染色体的形态。为了达到此目的，取出的骨髓细胞要经过低渗（kcl溶液）使细胞膨胀、染色体适当的分散。固定（甲醇、冰醋酸）使染色体保持完好的形态。染色（giemsa液）使染色体易分辨、观察。制备优良的标本可获得满意的观察效果。利用动物骨髓制作染色体观察标本取材容易，不需培养，不需无菌操作，比较简便，是生物学实验教学中常用的方法。一般选用的动物有青蛙、蟾蜍、小白鼠、大白鼠等。

[实验用品]

1. 动物：青蛙或小白鼠、大白鼠、蟾蜍，雌雄均可。

2. 试剂：0.02﹪秋水仙素、0.075mol/l氯化钾 (kcl)、3:1甲醇、冰醋酸固定液、吉姆萨（giemsa）染液、香柏油或液体石蜡、二甲苯。

3. 器材：解剖盘、小镊子、剪刀、注射器（2ml、5ml各一支）、刻度离心管、玻璃吸管、预冷载玻片、染色缸、玻片盒、量筒（10ml、50ml、100ml各一支），恒温水浴箱，盘架天平（配备等大的小烧杯两个）、电吹风、显微镜、吸水纸、擦镜纸、酒精灯、火柴。

[实验内容与方法]

一、试剂配制

1. 0.02﹪秋水仙素溶液：秋水仙素2mg，灭活生理盐水（蛙类0.65﹪、哺乳类0.85﹪的nacl）10ml溶解，避光保存。

2. 0.075mol/l kc1溶液：

原液： kcl 11.8g双蒸水100ml溶解。

使用液：原液1份，双蒸馏水19份混合，

3. 吉姆萨 (giemsa)染液：

原液：吉姆萨染粉0.5g，甘油33ml，甲醇33ml，配制时先将giemsa粉置于研体中，加入少量甘油，研磨至无颗粒，再加入余下的甘油，拌匀后放入56℃温箱中保温2小时，然后取出加入甲醇，充分拌匀，滤纸过滤用棕色瓶密封，避光保存，一般要放置2周后才能使用。

使用液：原液1份，ph6.8磷酸缓冲液9份稀释。使用液不宜长期保存，一般现配现用。

4. ph6.8磷酸缓冲液：该液可先配成甲液和乙液，然后混合使用。

甲液：kh2po4 0.907g蒸馏水100ml溶解。

乙液：na2hpo4·2h20 1.18g（或na2hpo4·12h20 2.38g）加蒸馏水100ml溶解。

使用液 (ph6.8)：甲液50.8ml，乙液49.2ml混合，该使用液也不易久放，一般也是现配现用。