荧光定量PCR中溶解曲线的意思
荧光定量pcr的溶解曲线理解:用Syber Green方法做完PCR后,用来判断产物是否相对专一。应结束后,逐渐加温。和SyberGreen分子结合的PCR产物随温度升高逐渐变为单链,就不能在和Syber
Green结合。
出现怪异的溶解曲线大部分都是机器设置或者反应体系的问题,建议:
1、将扩增产物跑一下电泳,看一下目的条带亮不亮
2、一般定量PCR扩增后目的片段的峰在80~90℃之间,反应条件确认一下设置是否有问题
3、适当增加模板量或者减少引物浓度。
技术原理
将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后,完成高温变性,低温复性,适温延伸的热循环,并遵守聚合酶链反应规律,与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断,荧光素游离于反应体系中,在特定光激发下发出荧光;
随着循环次数的增加,被扩增的目的基因片段呈指数规律增长,通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度,求得Ct值,同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照,即可得出待测标本目的基因的拷贝数。
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