分子生物学中最重要的环节之一是对微量蛋白质进行分析，使对编码待研究蛋白的 cDNA 序列的克隆成为可能。为有效地做到这一点，通常需要知道蛋白质的内序列。在这一方面，肽段的有效分离是极重要的。本实验来源于蛋白质纯化与鉴定实验指南，作者：朱厚础。
| 试剂、试剂盒 | 考马斯亮蓝 G乙酸甲醇Achromobacter 胰蛋白酶 I三氟乙酸乙腈2-丙醇 |
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| 仪器、耗材 | SpeedVac 型旋转浓缩器Tween-20UltrafreeTM MC 滤器C18 反相 HPLC 柱 |
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| 实验步骤 | 材料与设备
考马斯亮蓝 G(0.05% 的乙酸-20% 甲醇溶液）
乙酸 (5% 的 10% 甲醇溶液）
甲醇 (50% 的水溶液和 10% 的水溶液）
SpeedVac 型旋转浓缩器（Savant Instruments,Inc.)
Achromobacter 胰蛋白酶 I〔赖氨酰内肽酶;50ng/ul 的 0.1mol/LTri-HCl(pH9.0)〕
Tween-20〔0.1% 的 0.1mol/L Tris-HCl(pH9.0) 溶液〕
UltrafreeTM MC 滤器（22um;Millipore Corp.)
三氟乙酸（TFA;0.1% 的 50% 乙腈溶液)
C18 反相 HPLC 柱 (2.1X250 mm;5um,300A)(VYDAC)
乙腈
2-丙醇
操作程序
1) 用 SDS-PAGE 分离待研究蛋白。
2) 凝胶用 0.05% 考马斯亮蓝 G 染色 15~30 min。
3) 用含 5% 乙酸的 10% 甲醇溶液脱色。
4) 在水中浸泡 10 min。
5) 从凝胶上切下蛋白带，转移至微量离心管。切下一段不含蛋白质的凝胶作对照。如必要，可将凝胶切成较小的碎片，使之能容易地沉入微量离心管的底 部。
6) 各管加入 1 ml 50% 甲醇。室温下孵育 20 min。弃上清。
7) 各管加入1ml 10% 甲醇。室温下孵育 20 min。弃上清。
8) 凝胶碎片在 SpeedVac 型旋转浓缩器中干燥 2 min。
9) 各管加 10ul Achromobacter 蛋白酶 I。
10) 各管加最小体积的含 0.1%Tween-20 的 0.1mol/L Tris-HCl(pH9.0)—刚够淹没凝胶碎片即可。
注：凝胶碎片会膨胀, 故重要的是要保证它们仍能淹没在含去垢剂的缓冲液中。
11) 各管 30℃ 孵育 24 小时。
12) 各管在微量离心机中离心，将各管上清转移至 22-um Ultrafree MC 滤器内。12000r/min 离心 2 min。保留滤液。
13) 加 1 体积含 0.1%TFA 的 50% 乙腈溶液于各管留下的凝胶碎片中--足够淹没凝胶碎片。4°C 孵育 30 min。
14) 重复第 12、13 步操作。合并各样品的滤液。
15) 样品在 SpeedVac 型旋转浓缩器中旋转浓缩至体积小于 100 ml。加适量 HPLC 平衡液，制成供 HPLC 分析用的样品。
16) 用反相 HPLC C18 柱分离消化液中的肽段。用含 0.09% TFA 的乙腈/2-丙醇 (3:1) 梯度洗脱肽段。于 214mn(对肽键）和 295nm(对色氨酸）检测肽段的 UV 吸收。 展开 |
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