ELISPOT
随着酶联免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用，使体外检测各种细胞因子及抗体研究有了新的突破。在研究免疫应答机制时以往常用用酶联免疫吸附法（ELISA）检测体液中游离的细胞因子（CK）或抗体，但由于游离的循环抗体或CK的半哀期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反映体内的抗体及CK的水平。80年代，国外的科研工作者根据ELISA技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT）。
| 实验材料 | |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 1. PBS 溶解抗原为30 μg/ml，加100 μl/孔于PVDF 膜铺底的96 孔灭菌板过夜；
2. 第二天吸去包被液后，加5％FCS 的PRMI 1640 培养基100 μl 封闭1 小时，37℃；
3. 准备脾细胞悬液（用氯化铵去除红细胞，制备成单个脾淋巴细胞悬液）；
4. 从1 × 106/孔开始，按1:3 的稀释度开始逐孔稀释做不同浓度梯度，并做3 个复孔，37 ℃静置培养5 小时；
5. PBS 洗3～5 次，生物素化的抗鼠IgG 二抗孵育30 min；
6. PBS 洗3～5 次，链亲和素标记的碱性磷酸酶孵育30 min；
7. PBS 洗3～5 次，用底物BCIP/NBT 显色，显微镜下观察显色反应，显色后及时终止反应；
8. 计数每孔中的斑点数目，计算每106 个脾细胞中抗体分泌细胞数量。 展开 |
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