分析测试百科网 > 行业资讯 > 技术原理

一种无酚/无氯仿组织研磨从热带木本植物中提...（一）

2020.2.01

一种无酚/无氯仿组织研磨从热带木本植物中提取核酸的方法

概述：

木本热带植物中含有大量复杂的有机化合物，这些有机化合物会抑制提取RNA或DNA所需的化学程序，从而不利于后续研究及应用，如RNA测序和基因表达分析。为了克服这个问题，研究人员必须使用CTAB / PVP缓冲液的提取方案，而不能使用市售的DNA / RNA提取试剂盒。但是，这种提取方式耗时长、需使用有毒化学品（例如苯酚和氯仿），并且一次只能处理少量样品。为了克服这些问题，我们开发了一种基于CTAB / PVP的新方法，用于RNA或DNA提取，去掉了传统方法中的苯酚/氯仿步骤。此外，该方法同样适用于96孔深孔板，使用SPEX高通量组织研磨仪，一次研磨6块深孔板，同时处理576个样品，大大加快了处理速度。

我们的新方法，能够从夏威夷果、牛油果和芒果组织中，成功提取RNA，这些组织使用传统方法很难提取到RNA。而后我们还验证了，该方法提取的RNA成功地合成cDNA，以进行实时定量PCR并生成高质量的RNA-Seq库。该方法经轻微改动后，可用于从不同的热带和亚热带树种中快速提取DNA。

这种方法可以更安全、更快速地从困难样品中提取DNA和RNA，从而为将来在热带树木上的研究提供了便利。

正文：

一、背景

分子实验揭示了植物物种的生理遗传结构和功能，使种植者能够在不断变化的环境条件下提高生产力。然而，从植物中提取的RNA或DNA的传统方法中，使用的是草本植物（如拟南芥），但这种方法并不能很好地使用在某些植物种类上。例如，热带树木的组织中含有的多糖和多酚类物质，会阻碍传统方法中核酸的提取。从这些物种中提取RNA或DNA通常依赖于使用苯酚和氯仿，但它们易挥发、毒性强，如果研究人员的经常使用，危害很大，是不适合作为常规方法的。因此，我们试图通过摸索更安全、更快速的方法，来改善热带树木中RNA或DNA的提取实验。

在本项研究中，我们开发并测试了一种从热带/亚热带木本植物的各部分组织中提取DNA和总RNA（包括小RNA）的新方法，包括牛油果（Persea americana L.），夏威夷果（Macadamia integrifolia L.）和芒果（Mangifera indica L.）。我们的方法不需要苯酚或氯仿，可在不到1天的时间内，在96孔板中提取96个样品。可以对所得的RNA进行测序，并用于产生高质量的RNA-Seq读数。DNA提取方法还可以用于咖啡树（Coffea arabica L.）和桉树（Eucalyptus grandis L.）。该方法将有助于对热带树木进行新颖的分子研究，这在以前，对其进行大规模遗传调查和实验非常困难。

二、材料和方法

1、植物材料和组织研磨

从田间种植的牛油果树中收集了多种组织样本。哈斯·芒果品种：1243，夏威夷果品种：751，澳大利亚昆士兰州的咖啡和桉树。所有树木都已成熟（8至15岁）。从成熟叶片中提取DNA，而在茎，叶，根，花和腋芽组织上进行RNA提取。拟南芥品种：Columbia-0，豌豆品种：Torsdag，用于评估该方法对草本植物的有效性。

将新鲜样品在液氮或干冰中速冻，并在研磨成粉末（均质）之前，在-80°C下储存。冷冻的样品进行研磨，使用自动组织研磨仪（Geno /Grinder®2010，SPEX高通量组织研磨仪）。将叶、芽、花和根样品在2 ml样品管中研磨（每次最多96个样品），将茎组织在15 ml样品管中研磨（每次最多12个）。冷冻样品以1750 rpm的速度研磨1min，而后在−80°C的温度下冷冻30分钟，然后再循环破碎一或两次。使用刮刀将提取所需的粉末量（根据初步评估的体积/重量）转移到新的试管中。

2、溶液和试剂

CTAB缓冲液：CTAB 2%，NaCl 1.4M，EDTA 20 mM，Tris–HCl 100 mM，PVP40 2％
异丙醇100％
DTT（DL-二硫苏糖醇）0.5 mM
SDS 10％
70％乙醇
DNase Ⅰ+ DNase缓冲液
RNase A

3、RNA提取

组织裂解

将0.5–50 mg（不用更多）的研磨样品转移到2 ml试管中。加入625 µl CTAB缓冲液和25 µl DTT 0.5 mM（使用前将其混合）。充分涡旋并在60°C下培养15分钟，每5分钟涡旋一次。仅适用于困难样品：添加65 µl SDS 10％，并充分涡旋（如果只有少量组织，则仅添加40 µl SDS 10％）注意：在此阶段，SDS与CTAB一起沉淀，使样品浑浊。在室温下以20,000 g离心15分钟。注意：组织碎片将在试管底部沉淀，SDS / CTAB将在表面形成半固体层。从离心机中小心地移出试管，并将550–600 µl液相转移到新的2 ml管中或转移到96孔板中，然后进行核酸沉淀。

注意：

1、如果错误地吸收了太多的顶层，请将样品放入新的2 ml试管中，然后重复此步骤（提示：第二次离心后，直接从试管的底部吸取样品，顶层会粘在移液枪的枪头的外侧）。

2、根据组织的不同，可能会形成不同的沉淀物（牛油果的芽就是这种情况）。此时转移到过滤柱（Qiagen QIAshredder或Macherey–Nagel NucleoSpin过滤器）中，而不是2ml管中，并重复此步骤。

核酸沉淀

在每个管、深孔板孔、涡旋孔中加入550 µl预冷（-20°C）的异丙醇在-20°C下放置15min。注意：在此阶段，您可以将样品在-20°C下放置几天或几周样品管、深孔板在4℃下离心，深孔板1小时、3100g，样品管45分钟 20,000g。倾斜管/板以除去异丙醇加入1mL70％乙醇在4°C下度离心10-15min（3100 g对深孔板，20,000 g对离心管）倾斜管/板以除去乙醇对深孔板/样品管短暂离心，并用移液管除去残留的乙醇让样品在工作台上干燥10分钟。

DNase 处理

加入175 µl无RNase的水，上下吸匀，重悬沉淀将深孔板在50–60°C下放置2–3分钟，快速涡旋每个样品管或深孔板每个孔加入20 µl DNase和5 µl DNase I混合液（提前混合好的）。快速涡旋，快速旋转并在37°C下培养20–30分钟立即进行下一步。

RNA沉淀和洗脱

在每个管/孔中加入200 µl预冷（-20°C）异丙醇并涡旋孔在-20°C下放置15min（注：在此阶段，您也可以将样品在-20°C下放置几天）深孔板在3100 g、4°C离心1 h，样品管在20,000 g、4°C离心45 min倾斜样品管/深孔板以除去异丙醇加入1mL70％乙醇在4°C下离心10-15分钟（对于深孔板3100g，对于样品管20000g）倾斜样品管/深孔板以去除乙醇短暂离心，并用移液枪除去残留的乙醇让样品在工作台上干燥10min加入40–100 µl温的（60°C）不含RNase的水，并用力上下吸匀快速涡旋通过凝胶电泳和分光光度法确定RNA的数量和质量，并将样品保存在-80°C。

4、DNA提取

组织裂解和RNase处理

将最多50 mg的初始样品转移到2 ml样品管中加入400 µl CTAB缓冲液和4 µl RNase A + RNase缓冲液（如前所述提前混合好的）37°C下充分涡旋1h，并每15分钟反转一次加入30 µl 10％的 SDS，并充分涡旋（如果使用少量组织（<10–15 mg），则仅添加15 µl 10％的SDS）。（注意：SDS与CTAB一起沉淀，使样品浑浊）在室温下以20,000 g离心15分钟。（注意：组织碎片将在试管底部沉淀，SDS / CTAB将在表面形成半固体层）从离心机中小心取出，并将350–400 µl上清液转移到新的2 ml样品管中或2 ml 96孔板中，进行核酸沉淀。（注意：1、如果错误地吸收了太多的顶层，请将样品放入新的2 ml试管中，然后重复此步骤（提示：第二次离心后，直接从试管的底部吸取样品（顶层会粘在枪头的外侧）。2、视组织而异，如果形成脏/不清晰的沉淀物（牛油果的芽就是这种况），需转移到过滤柱（Qiagen QIAshredder或Macherey-Nagel NucleoSpin过滤器）中，而不是2 ml试管中，然后重复此操作步。）

DNA沉淀和洗脱

向每个样品管/深孔板孔和涡旋孔中加入350-400 µl预冷（-20°C）的异丙醇在-20°C下放置15min（注意：在此阶段，您也可以将样品在-20°C下放置几天）4℃下离心，深孔板：3100g、1小时，样品管： 20,000g、45min倾斜样品管/深孔板以除去异丙醇加入70％乙醇1mL在4°C下以3100 g的速度离心10-15min（对于深孔板）或20,000 g（对于离心管）倾斜样品管/深孔板以除去乙醇快速离心样品管/深孔板，并用移液枪除去残留的乙醇让样品在工作台上干燥10min加入90 µl温的（60°C）的无RNase的水，上下吸匀并充分涡旋以重悬沉淀。

5、数据统计与质量控制
通过在1.1％琼脂糖凝胶上电泳RNA或DNA样品进行质量控制。核酸通过加入Red Sage染色^®到凝胶。使用Gel Doc™系统（美国加利福尼亚州的Bio-Rad实验室）进行凝胶可视化。用NanoVue™ Plus分光光度计（GE Healthcare Life Sciences，宾夕法尼亚州，美国）测定样品的质量和纯度，测量RNA在280 nm和DNA在260nm的吸光度。

6、cDNA合成和定量实时PCR（qRT-PCR）
对于qRT-PCR，按照生产商的说明，通过在8 µl和2 µl的5×iScript Supermix（美国加利福尼亚Bio-Rad实验室）中使用250–500 ng的总RNA进行反转录获得cDNA。然后将cDNA稀释至每微升超纯水中0.5 ng当量RNA，用于工作模板溶液。然后定量实时PCR，每个反应试剂盒使用2微升的1mM的引物混合物，5μl cDNA和3μl SensiFAST™SYBR ®No-ROX Kit（Bioline）。按照生产商的说明扩增样品，并使用CFX384 Touch™实时PCR检测系统（美国加利福尼亚州Bio-Rad实验室）检测荧光。

7、cDNA合成和miRNA表达定量
为了定量miRNA的表达，按照生产商的说明，使用miScript Plant RT Kit（Qiagen，荷兰）试剂盒，通过连接反转录介质，从100到200 ng总RNA反转录合成低分子量cDNA。然后根据生产商的说明，使用超纯水稀释制备的cDNA，以实现最佳扩增。所述的qRT-PCR反应按照生产商的说明书（miScript SYBR Green PCR试剂盒，Qiagen，荷兰）进行使用：10μl的1×QuantiTect SYBR ®绿色主混合物，2微升1×miScript通用引物，2μl的0.8μM的miRNA特异性引物和2 µl模板cDNA。进行qRT-PCR运行，并使用Rotor-Gene Q 6000（Qiagen，荷兰）测量荧光。

8、RNA-Seq库的制备和测序
如Kerr等人所述制备RNA库的方式，准备牛油果、夏威夷果和芒果的茎、叶、根、花和腋芽组织。然后按照生产商的说明（Evrogen JSC，莫斯科，俄罗斯）使用Trimmer-2 cDNA标准化试剂盒对cDNA库进行标准化。使用CFX96 Touch™实时PCR检测系统（美国加利福尼亚Bio-Rad实验室），使用Illumina测序平台的库定量试剂盒（KAPA Biosystems，美国波士顿），通过qRT-PCR对库进行定量。使用从qRT-PCR计算的摩尔浓度将库标准化为4 nM的工作浓度，并调整片段大小。然后使用Illumina测序仪（NextSeq）对RNA-Seq样本进行测序。

9、RNA-Seq读取质量控制评估和定位
Trimmomtatic v. 0.35 用于去除启动子，根据质量修剪和过滤读取结果。使用Deconseq v. 0.4.2，从读取结果中去除序列污染物。使用FastQC（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）检查序列读取质量。

为了验证我们的RNA测序结果，我们将读段映射到已发表的转录组和基因组序列草案中。使用HISAT v.2（默认设置）将修剪的读取结果映射到已发布的参考转录组和基因组序列中。