关注公众号

关注公众号

手机扫码查看

手机查看

喜欢作者

打赏方式

微信支付微信支付
支付宝支付支付宝支付
×

肠出血性大肠杆菌O157核酸检测试剂盒使用说明

2020.4.23

肠出血性大肠杆菌O157核酸检测试剂盒(恒温荧光法)使用说明


◆ 产品说明

致病菌检测系列基于独特的恒温荧光检测技术,可针对食品、饲料等样品中的致病微生物的特异核酸片段进行扩增,仪器实时监测扩增过程中的荧光信号变化,自动判读结果。本产品用于肠出血性大肠杆菌O157的检测。检出限为103 CFU/ml   

◆ 产品组成( 48测试)

011051M


试剂

含量

A-O157-I

1200μL × 1支

B-I

  55μL × 1支

C-I

1200μL × 1支

NG-I

  50μL × 2支

PG-O157-I

  50μL × 1支

◆ 适用仪器

Dhelix 1610、Dhelix 3210、ESE Tube Scanner、Genie II、Deaou-308c等恒温荧光检测仪, ABI 7500,LightCycler480,CFX 96等荧光PCR仪。

◆ 自备耗材和仪器

①灭菌1.5mL或2.0mL离心管;②灭菌0.2mL PCR管或八联管;③冰盒;④移液器(0.5-10μL,10-100μL,100-1000μL)及配套灭菌吸头;⑤离心机;⑥涡旋混匀器;⑦金属浴

◆ 注意事项

1.本试剂检测灵敏度高。为了防止污染,实验要分区操作。

1)第一区:试剂准备区。

2)第二区:样本制备区。

3)第三区:模板添加区。

4)第四区:扩增及产物分析区。

★ 分区之间最好进行物理性隔离,避免人为因素造成的污染。

2.实验过程中穿戴工作服和乳胶手套,不同区域独立使用工具,需更换手套和实验服。

3.严格按照操作步骤操作,试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。

4.反应液中的成分对光敏感,应避光保存。试剂使用前要完全解冻,但应避免反复冻融,推荐使用前离心30秒,并按检测频次将反应液以适当体积分管保存。

5.反应结束后,扩增管请置于密封袋内丢弃,当日清理,开盖易造成气溶胶污染,禁止开盖。

6.不同批号试剂请勿混合使用,在有效期内使用。

7. 检出限为103 CFU/ml是以1 ml 103 CFU/ml增菌液离心后收集菌体再提取的细菌基因组DNA作为模板。

◆ 样品处理

参照 《GB/T 4789.36-2008食品卫生微生物学检验大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验》中的5.1处理样品,对样品进行前增菌,制备的菌液保存待用。

样品采集后应尽快检验。若不能及时检验,可在2℃~4℃保存18h。以无菌操作取检样25g(ml)加入到含有225ml mEC+n肉汤的均质袋中,在拍击式均质器上连续均质1min~2min;或放入盛有225ml mEC+n肉汤的均质杯中,8000 rpm/min~10000 rpm/min均质1min~2min, 于36 ℃±1℃培养18h~24h。

详细步骤请按照标准操作或查阅食安通软件。

◆ 实验操作

将试剂完全解冻,各组分离心30s。

1. 试剂配制(试剂准备区,放置于冰盒中进行):

若有N个待检样品,则参照下表,按照N+2个数量计算各组分用量(N个待检样品+1个阴性对照+1个阳性对照),将反应液置于0.6ml或者1.5ml离心管中,涡旋混匀,离心30秒,分装于0.2ml PCR管中,并向每管加入1滴C-I(约20μl)。

试剂

使用量

A-O157-I

22×(N+2)μL

B-I

 1×(N+2)μL

反应液总体积

23×(N+2)μL

  1. 模板制备(样本制备区)

建议使用试剂配套细菌组DNA提取系列产品,具体过程详见产品说明书。

3.添加模板(模板添加区,放置于冰盒中进行)

在步骤1中已含有反应液的PCR管中加入2μL模板,顺序为NG-I、待测样品模板、PG-O157-I。涡旋混匀30s,离心1min,立即进行扩增反应。

4. 扩增反应(扩增及产物分析区)

①恒温仪器63℃条件下反应45 min。

②若使用荧光定量PCR仪,则荧光基团选择FAM,淬灭基团选择None,将63℃ 15 s,63℃ 45 s作为一个循环,于63℃ 45 s处收集荧光信号,45个循环。 

其他仪器请参照仪器说明书进行设置。

◆ 结果判定

①仪器自动判定结果,若显示“阳性”,则样品中含有肠出血性大肠杆菌O157;若显示“阴性”,则样品中不含有肠出血性大肠杆菌O157或含量低于检测限。

②在荧光定量PCR仪上,根据有无“S”型扩增曲线判定结果。若有“S”型扩增曲线,则样品中含有肠出血性大肠杆菌O157;若无“S”型扩增曲线,则样品中不含有肠出血性大肠杆菌O157或含量低于检测限。 

NG反应管结果显示“阴性”,PG反应管结果显示“阳性”,此次检测结果有效,否则无效。


推荐
热点排行
一周推荐
关闭