实验步骤

##一、 从组织和培养细胞中分离RNA

1.TRIzol试 剂（Invitrogen)。该试剂含有苯酚和硫氰酸盐化合物，操作时应穿实

验服，戴手套，存放于 4°C 。

2.氯仿。

3.异丙醇。

4.乙醇。

5.焦炭酸二乙酯（DEPC) 处理的水。

6.无DNA试剂盒（Ambion)。贮存于一 20°C 。

##二、 CDNA 合成

1.Superscript™ II， RNase H-反 转 录 酶（200 U/(nL; Invitrogen)。 一 20°C下可稳

定忙存两年以上。

2.5X 第一链合成缓冲液： 250 mmol/LTris-HCI， pH 8. 3， 375 mmol/L K C l, 15

mmol,L MgCl2， 贮存于一 20。。 。

3.0. lmmol/L 二硫苏糖醇（DTT)，贮存于一 20°C 。

4.dNTP 混合物： dNTP 各 1 0 mmol/L ，贮存于一20°C 。

5.18 碱 基 的 随 机 引 物（25 pmol/L ): A 3， 5'-AATCATGAGCTCTCCTGG——3';B3, 5』-CATACACGCGTATACTGG——3』； C3, 5'-CCATGCGCATGCATGAGA- 3 : 贮存于一20。。。

6.RNaseOMT™ 重组核糖核酸酶抑制剂 UOU/^L ; Invitrogen), I t 存于一20℃

##三、 FRAP-PCR

1.QiagenT叫 D N A聚 合 酶（5 U/|uL; Qiagen)， |^；存于一20。 C 。

2.Qiagen IOXPCR 缓冲液： Tris-HCl， KCl，（NH4)2SO4， 15 mmol/L MgCl2，p H 8.7, C 存于一20°C 。

3.25 mmol L MgCl2， I t存于一20°C 。

4.焦炭酸二异酯（DEPC) 处理过的水。

5.dNTP 混合物： dNTP 各 1 0 mmoL/L ， JC 存于一20° C 。

6.5'端用罗丹明标记的随机引物（lOfxmol/L ; A3、 B3 或 C3)，贮存于一20°C ，避光。

7.QIAquick PCR 纯化试剂盒（Qiagen)

##四、凝胶电泳

1.制胶溶液： 6 % 丙 烯 酰 胺（29: 1 丙烯酰胺-bis丙烯酰胺），含 7 mol/L 尿素和1XTBE缓冲液。

2.1父丁6£缓冲液： 89 1^11 〇 1， 1 1 1 ^ 碱 ， 89 111111〇 1/1^硼酸， 2 111111〇 1/乙£0丁八二钠

盐 ， pH 8. 3。

3.上样缓冲液： 9 9 % 甲酰胺， I mmol/L EDTA， pH 8.0，〇. 〇〇 9% 二甲苯氰，0.009% 溴酚蓝。

4.TEMED。

5.25% 过硫酸铵。

6.FDD垂直电泳系统，包 含 60孔梳子和低背景荧光的玻片（GenHunter)。

7.Sigmacote 桂 胶 液（Sigma-Aldrich)， JC存于 4°C 。

8.可提供电压>1700 V 的直流电源。

9.突光成像扫描仪： Typhoon 9210 可 变 模 式 成 像 仪（Amersham)。

10.可打印 llin X 17in® & 的喷墨打印机，用于打印实际尺寸的凝胶图像。

11.刀片。

##五、 PCR 产物的分离、再扩增和克隆

1.胶 原（20 叫 ZmL), C 存于_20°C 。

2.3 mol/L 乙酸钠。

3.乙醇。

4.焦炭酸二乙酯（DEPC) 处理过的水。

5.PCR 试剂，见 2.3 (注意： lOfxmol/L 未标记的随机引物）。

6.TOPOTA® 克 隆 试 剂 盒（Invitrogen)。 OneShot® 感 受 态 大 肠 杆 菌 贮 存 于—80°C , PCR TOPO® 克隆载体贮存于一2CTC。

7.SOC 培养基： 2 % 胰蛋白胨， 0 . 5 % 酵母提取物， 10 mmol/L NaCl， 2. 5 mmol/L KC1， 10 mmol/L MgCl2， 10 mmol/L MgSO4， 20 mmolZL 葡萄糖。

8.L B 培养基。

9.氨节西林（1 0 mg/mL)， JC存于一20°C 。

10.琼脂。

11.X-gal (20 mg/mL)，避光忙存于_2 〇 °C 。

12.M13 引物：正 向（5'-GTAAAACGACGGCCA0 3 ' ) ，反 向（5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3')，贮存于一20°C 。

13.QIAprep 离心法小量质粒抽提试剂盒（Qiagen)。3. 方法