过氧化物酶活性测定的方法有哪些

实验
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过氧化物酶活性的测定（比色法）
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
一、原理
在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在
470
nm
处有最大吸收，可用分光光度计测量
470
nm
的吸光度变化测定过氧化物酶活性。
二、实验材料、试剂与仪器设备
（一）实验材料
马铃薯块茎。
（二）试剂
1
．
100
mmol
／
L
磷酸缓冲液
pH6.0
（见附录）。
2
．反应混合液：
100
mmol
／
L
磷酸缓冲液（
pH6.0
）
50
mL
于烧杯中，加入愈创木酚
28
μl
，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入
30
%
过氧化氢
19
μl
，混合均匀，保存于冰箱中。
（三）仪器设备
分光光度计，研钵，恒温水浴锅，
100
mL
容量瓶，吸管，
离心机。
三、实验步骤
1
．称取植物材料
1
g
，剪碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，以
4000
r
／
min
离心
15
min
，上清液转入
100
mL
容量瓶中，残渣再用
5
mL
磷酸缓冲液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，贮于低温下备用。
2
．取光径
1
cm
比色杯
2
只，于
1
只中加入反应混合液
3
mL
和磷酸缓冲液
1mL
，作为对照，另
1
只中加入反应混合液
3
mL
和上述酶液
1mL
（如酶活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长
470
nm
下吸光度值，每隔
1min
读数一次。
四、结果计算
以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以
ΔA
470
/[min
•
g
（鲜重）
]
表示之。也可以用每
min
内
A
470
变化
0.01
为
1
个过氧化物酶活性单位（
u
）表示。
过氧化物酶活性
[u/
（
g
•
min
）
]=
式中：
Δ
A
470
——反应时间内吸光度的变化。
W
——植物鲜重，
g
。
V
T
——提取酶液总体积，
mL
。
V
s
——测定时取用酶液体积
,
mL
。
t
——反应时间，
min
。