甲基化的检测方法

(1) 甲基化特异性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP）

用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。

(2)亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）

用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。

(3) 高分辨率熔解曲线法（High Resolution Melting，HRM）

在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC含量发生改变，从而导致熔解温度的变化。

(4) 基因组直接测序法

基因组直接测序法是过去一直沿用的DNA甲基化的研究方法，用Maxam—Gilbert化学裂解法对基因组DNA进行处理，并以连接介导的PCR来放大信号强度，然后进行序列分析。此法是基于5mC在标准的Maxam—Gilbert胞嘧啶化学裂解反应中不被裂解，故5mC可通过在测序胶上缺少对应于胞嘧啶降解反应产物的一个条带而得以鉴定。如采用MnO4- 哌啶法，结果则反之因此在检测5mC时，此两法可提供完全互补的检测信息。该法与LM-PCR结合后，大大降低了对基因组DNA的需要量（1～2 ng）。当5mC和C同时处于不同DNA分子上的同一位点时，该位点至少要有25%的5mC才能被N2H4法检测到；MnO4-法比N2 H4法更灵敏。因为这两种基因组DNA化学修饰法均有抑制DNA聚合酶延伸的特性，无须进行DNA哌啶裂解就可通过基因组直接测序技术进行甲基化分析。