| 实验步骤 | 一、样品缓冲液的配制
根据 SDS 电泳的原理，样品缓冲液中必须含有 3~4 倍于蛋白的 SDS 和足以断裂二硫键的还原试剂（2%~3% 二硫苏糖醇或 4%~5% β-巯基乙醇 )。由于巯基乙醇具有强挥发性，最好在配制样品前再将其加到样品缓冲液中。配制好的样品还必须在 100℃ 水浴中保温 3~5 分钟（对一些样品可在 37℃ 保温 6 小时)。在每克蛋白质断裂二硫键并结合 1.4 g 单体 SDS 后，SDS-多肽胶束带负电，具有恒定的荷/质比。胶束的斯托克斯（Stokes) 直径和分子质量成正比，通常在样品溶液中加 1% 到 2% ( W/V） SDS，在凝胶中加 0.1% SDS。
连续电泳的样品缓冲液可根据缓冲系统选择如下：
1. 磷酸缓冲系统的样品缓冲液（0.01 mol/L, pH 7.1)
0.2 g SDS + 1 ml 磷酸缓冲缓冲液（0.2 mol/L pH 7.1）+ 0.2 ml β-巯基乙醇 + 0.1 mg 溴酚蓝，用双蒸水稀释到 20 ml。4℃ 保存。
2. 咪唑缓冲系统的样品缓冲液（0.01 mol/L, pH 7.0)
0.2 g SDS + 2 ml 咪唑缓冲液贮液（0.1 mol/L pH 7.0）+ 0.2 ml β-巯基乙醇 + 0.1 mg 溴酚蓝，用双蒸水稀释到 20 ml。4℃ 保存。
不连续电泳的样品缓冲液（0.08 mol/L Tris-HCl, pH 6.8) 通常用 1.6 ml 浓缩胶缓冲贮液（1 mol/L Tris-HCl，pH 6.8) + 4 ml 10% SDS + 0.3 g 二硫苏糖醇（或 1 ml β-巯基乙醇）+ 2.5 ml 87% 甘油 + 0.1 mg 溴酚蓝，用双蒸水稀释到 20 ml。4℃ 保存。如采用pH 8.8 Tris-HCl 缓冲液或其他缓冲液会得到不同的分离结果。
小孔梯度 SDS 电泳样品缓冲液（0.15 mol/L Tris-HCl，1% SDS ) 的配制：0.2 g SDS + 2 ml 凝胶缓冲贮液（1.5 mol/L Tris-HCl，0.4% SDS， pH 8.8 ) + 0.1 mg 溴酚蓝，用双蒸水稀释到 20 ml，4℃ 保存。
二、蛋白标准的准备
选择合适分子质量范围的市售蛋白标准或自己配置一套蛋白标准（5~7 种蛋白）溶解在样品缓冲液中，与样品一样在 100℃ 煮 3~5 分钟，分装，在 -20℃ 可保存 6 个月。但使用前还需再煮和加适量 β-巯基乙醇（如果样品缓冲液中是用 β-巯基乙醇作还原剂)。
三、样品浓度和加样要求
样品溶解后应分装。如短期保存，可放在 4℃，如长期保存应放在 -20℃。使用前还需再次在 100℃ 煮 3~5 分钟，并加 β-巯基乙醇（如样品缓冲液中原来用 β-巯基乙醇作还原剂 )。
样品浓度和加样要求同常规聚丙烯酰胺凝胶阳极电泳，请参阅 “常规聚丙烯敢胺凝胶电泳”。 展开 |
|---|
