TLP基因的表达模式分析
实验概要
本实验对水稻、拟南芥及杨树的TLP基因表达模式进行了分析，为进一步研明植物中TLP基因的功能奠定基础。
实验步骤
1. 水稻TLP基因的RT-PCR分析
1) 植物材料
选取水稻的根、茎、叶、花和种子的新鲜组织用于RNA的提取。水稻材料采集后，用液氮速冻，以保证RNA不被降解，然后冻存于-70℃超低温冰箱，以备提取组织RNA时使用。
2) 植物组织提取RNA
试剂和器皿：所有试剂都用DEPC水配置，所有器皿都在180℃烘8hr或者在双氧水中泡0.5hr以上。
试剂：RNA抽提缓冲液：0.2mo1/L Tris-Cl (pH=0.8)，0.4mo1/L LiC1，25mmol/LEDTA，1% SDS；3mol/L NaAc (pH=5.2)；2mol/L LiCl；RNase free的水饱和酚；氯仿；无水乙醇；70%乙醇；Dnase(RNase free)等。
步骤：新鲜的植物组织适量放置于盛有液氮的研钵中，保持低温环境，用小磨棒研磨成粉，装入1.5mL的离心管中，再加入40uL RNA抽提缓冲液和40uL酚，置于冰上。剧烈震荡5次。13200rpm离心6min，取上清，移入另一装有300uL氯仿的1.5mL离心管中，剧烈震荡。13200rpm离心6min，取上清，移入另一装有1000uL无水乙醇和40uL 3mol/L NaAc的1.5mL离心管中，-20℃放置20min以上。13200rpm离心10min，弃上清。70%乙醇洗一次，13200rpm离心5min，弃上清，超净台吹干。加入10-30uL DEPC水。-20℃短期保存，-70℃长期存放。
3) 引物设计
由于TLP基因家族成员间含有一些高度保守的序列，我们通过BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)的方法，避免TUB和F-box结构域或者其他一些高度同源序列被用于引物设计，以确保每对引物特异扩增所需的序列。引物序列略。
4) 反转录和PCR
a. 总RNA变性解链：总RNA 3.0uL；Oligo (dT) 5.5uL；DEPC处理的水3.5uL；70℃温浴5min后，立即放入冰浴。
b. 逆转录前处理：M-Muly 5XBuffer 5.0uL；dNTP 5.0uL；RNasin 0.5uL(25units)；DEPC处理的水6.5uL；总体积为30uL； 70℃温浴10min。
c. 逆转录反应：加入M-Muly逆转录酶1.0uL (200units)。离心管放入42℃水浴，60min。
d. cDNA第一链合成后的处理：逆转录以后在体系中加入1uL逆转录酶抑制剂，将离心管放入70℃，水浴10min，-20℃保存。
e. PCR反应条件：94℃5min；94℃40sec；56-58℃40sec；72℃1min，30个循环；72℃5min。阳性对照为水稻Actin基因。
2. 基于MPSS的拟南芥和水稻TLP基因的表达分析
为分析拟南芥与水稻基因组中旁系同源TLP基因组织表达模式，本研究还搜索了拟南芥和水稻MPSS数据库中的17-bp表达信号来确定其表达模式。首先，在MPSS数据库中获得了所有水稻和拟南芥中TLP基因17-bp信号表达的组织。利用公式P=T1/T2求取交叠表达组织频率。其中T1表示在一对旁系同源TLP基因均会在其中表达的组织数目，而T2表示在一对旁系同源TLP基因中至少一个会在其中表达的组织数目。
3. 基于EST的杨树TLP基因的表达分析
表达序列标签(EST)为在mRNA水平上研究目的基因的表达提供了有效的工具。通过对不同数据库中目的基因对应的EST或cDNA出现的频率可以来了解其组织表达情况。为分析杨树基因组中TLP基因的组织表达特征，本研究利用杨树TLP基因的编码序列(CDS)搜索了NCBI的EST数据库。通过对杨树不同种的基因编码的蛋白质序列的比较发现：杨树不同种间的序列是高度相似的甚至是一致的。本研究中不仅采用了杨树的EST序列，还采用了其他杨树种和杂交种的EST序列，包括：P. trichocarpa，P. tremula×P alba，P. tremula×P. tremuloides，P. deltoids，P. tremuloides，P. euphratica，P. trichocarpa×P.deltodides，P. trichocarpa×Pnigra and P. tremula。该搜索利用Blasm搜索NCBI的EST数据库，参数为默认，所得结果的匹配率>95%、匹配长度>160bp且E≤10-10被认为是该基因的EST表达序列。为分析杨树的TLP基因的组织特异性表达，将所得到的杨树EST序列根据其组织来源分成了8类组织：花、树皮、叶、根、芽、木质部、愈伤组织和其他。
