实验概要

细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。

主要试剂

1、1.5M Tris-HCl(pH 8.0)

2、1M Tris-HCl(pH 6.8)

3、10% SDS

4、10´电泳缓冲液(pH 8.3)

5、10%过硫酸铵（AP）1、30%储备胶溶液

6、2´SDS电泳上样缓冲液

7、考马斯亮兰染色液

8、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。

实验步骤

采用垂直式电泳槽装置

（一）聚丙烯酰胺凝胶的配制

1、分离胶(10%)的配制:

ddH2O           4.0ml

30%储备胶       3.3ml

1.5M Tris-HCl    2.5ml

10% SDS         0.1ml

10% AP          0.1ml

取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μl封底,余加TEMED 4μl ,混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平。（凝胶完全聚合需30-60min）

2、积层胶（4%）的配制：

ddH2O             1.4 ml

30%储备胶        0.33 ml

1M Tris-HCl      0.25 ml

10%SDS          0.02 ml

10%AP           0.02 ml

TEMED              2 μl

将分离胶上的水倒去,加入上述混合液,立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需15-30min。

（二）样品处理：将样品加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃加热3-5min，离心12000g×1min，取上清作SDS-PAGE分析，同时将SDS低分子量蛋白标准品作平行处理。

（三）上样: 取10μl诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中,并加入20μl低分子量蛋白标准品作对照。

（三）电泳:在电泳槽中加入1´电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，电泳时，积层胶电压60V,分离胶电压100V,电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止（约需3hr）。

（四）染色:将胶从玻璃板中取出，考马斯亮兰染色液染色，室温4-6hr。

（五）脱色:将胶从染色液中取出,放入脱色液中,多次脱色至蛋白带清晰。

（六）凝胶摄像和保存：在图像处理系统下将脱色好的凝胶摄像，结果存于软盘中，凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中。

注意事项

1、实验组与对照组所加总蛋白含量要相等。

2、为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的pH值要准确，10%AP在一周内使用。室温较低时，TEMED的量可加倍。

3、未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护。