毛细管电泳法检测肺癌p53基因第七外显子的突变

作者：刘勇1,2 王荣*1,2 高 岚2 贾正平1 辛晓婷1,2 谢 华1 马 骏1   

作者单位：1(兰州军区兰州总医院临床药理基地，兰州 730050) 2(兰州大学生命科学学院，兰州 730000) 
【摘要】  p53基因点突变在肺癌的发生过程中起重要作用，检测基因点突变的方法学研究将有助于临床准确诊断肺癌。本实验用PCR扩增包含249位密码子的肺癌及癌旁正常组织p53基因第七外显子，扩增样品分别经96 ℃变性和HaeⅢ酶切处理，以CESSCP、CERFLP、PAGESSCP和PAGERFLP对其突变情况进行检测，并从上样量、时间、检出限和检出率4个方面进行比较。PAGE凝胶浓度为15%;CE筛分介质PEO浓度3.0%，pH 8.2，电压15 kV，温度15 ℃，λex=488 nm，λem=520 nm荧光检测。检出率由高到低分别为：CESSCP>PAGESSCP>CERFLP>PAGERFLP。CESSCP可作为大规模肺癌早期诊断的简便可靠的方法。

【关键词】  肺癌， 基因突变， 毛细管电泳， 聚丙烯酰胺凝胶电泳， 单链构象多态性， 限制性片段长度多态性

            1 引 言

　　p53基因是一个具有独特作用的抑癌基因, 突变后具有癌基因作用，一直是癌症研究的热点[1]，是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的基因，其第七外显子是突变的集中区域，237～249氨基酸位置的基因编码区是一个高度保守区密切相关的热点区[2]。通过对肺癌相关基因的研究，将有助于肺癌早期诊断和治疗方案的制定，降低死亡率，促进其它癌症诊断方法学的研究。

　　常用检测基因突变的方法有：单链构象多态性(SSCP)、限制性片段长度多态性(RFLP)、温度梯度凝胶电泳(TGGE)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、DNA芯片技术、DNA测序等，其中SSCP和RFLP使用最为广泛。这些方法大多与聚合酶链式反应(PCR)相结合，检测手段依赖平板凝胶电泳，在准确性、灵敏度、检测成本及时间等方面存在不足[3,4]。近年来，越来越多的研究者将毛细管电泳(CE)用于检测基因突变的研究中。Mitchelson等[5]用CE对基因点突变进行了筛查;Felmlee等[6]研究了CE在临床诊断DNA方面的潜在作用;施维等[7]用自制线性聚丙烯酰胺凝胶电泳柱对寡聚核苷酸的分离进行了研究。越来越多的研究表明，与其它检测技术相比，CE具有高效、快速、样品用量少、自动化程度高等优点，在核苷酸分析方面具有独特的优越性。

　　本实验采用SSCP、RFLP结合聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)以及CE对肺癌p53基因突变进行研究，并对这些方法进行了比较，为寻找科学准确的基因诊断方法提供依据。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　P/ACE System 5000型毛细管电泳仪、P/ACE System 5000 station数据处理软件、P/ACE Systemlaser module 488 nm激光发射器(美国Beckman公司);石英毛细管柱(河北永年光导纤维厂)。

　　聚环氧乙烷(PEO，Mr=300000);限制性内切酶HaeⅢ(TaKaRa);丙烯酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸铵(APS，国药集团化学试剂有限公司);γ甲基丙烯酰基三(甲氧基)硅烷(MAPS，A Johson Matthey公司);三羟甲基氨基甲烷(Tris，上海山浦化工有限公司);硼酸、乙二胺四乙酸二钠(EDTA，天津化学试剂厂);SYBR GreenⅠ核酸染料(厦门百维信公司);pUC19 DNA/MspⅠ(HpaⅡ)DNA Marker(上海生物工程技术有限公司)。

　　肺癌及癌旁正常组织各40例取自兰州军区兰州总医院病理科，所有标本均来自肺部切除并经病理切片证实。

　2.2 组织DNA提取，引物设计及PCR扩增

　　酚氯仿法提取肺癌及癌旁正常组织基因组DNA。PP5.0软件设计p53基因第七外显子，包含249位密码子突变位点的引物，该位点突变后能引起限制性内切酶HaeⅢ酶切位点(GGCC)消失，引物由上海生物工程技术有限公司合成。上游：5′TAT CTC CTA GGT TGG CTC TG3′，下游：5′TGA CCT GGA GTC TTC CAG T3′，长度为124 bp。PCR扩增条件： 94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共28个循环。

　　2.3 PAGESSCP检测

　　扩增产物加入1/6体积上样缓冲液，96 ℃变性15 min，冰浴5 min，立即上样3 μL，凝胶浓度为15%，125 V电泳8 h;凝胶作常规AgNO3染色。

　　2.4 PAGERFLP检测

　　酶切体系(30 μL)：HaeⅢ 5U、扩增产物9 μL、三次蒸馏水18 μL、缓冲液2 μL。37 ℃水浴1 h，升至80 ℃灭活20 min。扩增产物经酶切后，以15%PAGE检测，样品中加入1/6体积上样缓冲液，125 V电泳6 h;常规AgNO3染色。

　　2.5 CESSCP和CERFLP检测

　　参考文献[6]的方法涂层毛细管柱，λex=488 nm，λem=520 nm荧光检测，P/ACE System station数据处理软件采集数据。变性处理与酶切样品22 μL分别加入5 μL TBE，3 μL SYBR GreenⅠ，混匀后负极电动进样。采用实验室已确定的PEO分离pUC19 DNA/MspⅠ(HpaⅡ)DNA Marker最佳条件，对肺癌p53基因的突变情况进行检测。

　　3 结果与讨论

　　3.1 最佳分离条件

　　CE分离pUC19 DNA/MspⅠ(HpaⅡ)DNA Marker的最佳条件[8]： 3.0%PEO，pH 8.2，电压15 kV，温度15 ℃。由图1可见，所有DNA片段基本得到基线分离，电泳在15 min内完成，分离效果好，时间短。

　　3.2 PCR扩增结果

　　1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，目的片段长度为124 bp。由图2可见目的片段扩增成功。

　　图1 毛细管电泳分离pUC19 DNA/MspⅠ(HpaⅡ) DNA Marker结果

　　Fig.1 Result of pUC19 DNA/MspⅠ(HpaⅡ) DNA Marker separation by CE

　　1. 26 bp; 2. 34 bp; 3. 67 bp; 4. 110, 111 bp; 5. 147 bp; 6. 190 bp; 7. 242 bp; 8. 331 bp; 9. 404 bp; 10. 489 bp; 11. 501 bp。 图2 p53基因第七外显子扩增结果

　　Fig.2 Result of p53 gene exon 7 amplification

　　M. DL500TM DNA Marker; 1. 癌旁正常组织(Normal tissue), 2，3. 肺癌组织(Lung cancer tissue)。

　　3.3 PAGESSCP结果

　　双链PCR产物发生变性，与正常对照组相比，PAGE可得到3种异常迁移带型： 两条单链带皆发生迁移、多出一条或多出两条单链带，这些都是异常的单链DNA(ss)迁移，由此可判断产物发生了碱基改变。

　　对凝胶浓度进行考察：配制8%、10%、12%和15%的凝胶，浓度为8%～12%时，电泳时间较短，约5～7 h，但DNA双链(ds)与ss，ss与ss之间距离较近，不易区分;浓度为15%时，效果较好，电泳时间约8 h。本实验采用的凝胶浓度为15%，结果如图3所示：由图3可见2～5均有异常条带迁移，所有样品中均有dsDNA，以及癌旁正常组织变性得到的ssDNA。

　　3.4 PAGERFLP结果

　　突变常引起某一区域酶切位点消失，或产生新的酶切位点。用适当的限制性内切酶进行酶切，突变基因产生与正常基因长度不同的片段可用于判断突变的发生。PAGERFLP结果见图4。

　　扩增产物经酶切后，癌旁正常组织得到85和39 bp两条片段;肺癌组织为124 bp一条片段。理论上15%凝胶最小可分离25 bp DNA片段，但实验过程中癌旁正常组织39 bp这条小片段接近分离低限，PAGE通常检测不到。

　　3.5 CESSCP结果

　　PCR反应剩余物质在紫外检测的ds之前会产生一些杂峰，采用荧光检测可消除杂峰干扰[8]，本实验采用荧光检测，结果见图5。

　　图5a 为变性癌旁正常组织扩增样品，10 min前一条未变性完全ds，12.5～15.0 min有两条ss;图5b和5c为变性的具代表性肺癌组织，除有正常样品的ds，ss外，还具有异常ss。

　　3.6 CERFLP结果

　　癌旁正常组织和肺癌组织扩增产物酶切后进行CE检测(见图6)，10 min内即可完成。对于PAGERFLP检测不出的39 bp 这条小片段，CE则能够清晰地检测到。

　　图5 CESSCP结果

　　Fig.5 Result of CESSCP

　　a. 癌旁正常组织(Normal tissue); b, c. 肺癌组织(Lung cancer tissue), 1. ds(Double strand); 2, 3. 癌旁正常组织变性后野生型ss(Denaturated wild type single strand of normal tissue); 4, 5. 肺癌组织变性后突变型异常ss(Denaturated mutant type single strand of lung cancer tissue)。 图6 CERFLP结果

　　Fig.6 Result of CERFLP

　　a. 癌旁正常组织(Normal tissue); b. 肺癌组织(Lung cancer tissue)。3.7 4种检测方法的比较

　　根据以上实验结果，从上样量、时间、检出限及检出率4个方面对4种方法进行评价，结果见表1。

　　检出率从高到低为：CESSCP>PAGESSCP>CERFLP>PAGERFLP。40例癌旁正常组织中，4种方法均未检测到基因突变。

　　以上结果可以看出，CE各个方面都优于PAGE检测方法：完成一次电泳只需要几十分钟，结合荧光检测，无需染色过程节省大量时间，并且上样量为nL级，检出限与检出率比PAGE高，分析时间短、分辨率高、样品用量少、自动化程度高等优点对于临床检测基因突变十分重要。表1 检测方法比较

　　Table 1 Comparison of detection methodsPAGESSCPRELPCESSCPRFLP上样量 Sample volume3～5 μL3～5 μLnLnL时间 Time样品处理 Sample treatment20 min～90 min20 min～90 min检测过程 Detection process～7 h～7 h～30 min～30 min总耗时 Total timeconsuming～8 h～9 h～1 h～2 h检出限 Detection limit[10～11]1 ng1 ng10-12 mol/L10-12 mol/L检出率

　　Detection rate(%)癌旁正常组织 Normal tissue0(0/40)0(0/40)0(0/40)0(0/40)肺癌组织 Lung cancer tissue27.5(11/40)12.5(5/40)35.0(14/40)17.5(7/40) CESSCP与CERFLP相比，在肺癌组织p53基因突变检测方面，检出率分别为35.0%(14/40)和17.5%(7/40)，CESSCP的检出率明显高于CERFLP。因此，SSCP结合CE不仅能满足临床检验快速，精确等要求，而且能在基因突变点检测过程中提供更多的信息。

　　对于癌症这种复杂的疾病来说，仅靠一种检测手段来达到精确诊断，是非常困难的。针对不同种类的疾病采取不同的处理方法，不断寻找更加准确的检测方法是分析工作者研究的重要工作。

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