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培养细胞的电子显微镜观察实验

2019.10.20

一、透射观察法

透射观察必须切片,根据培养细胞种类和培养方法不同分原位切片
和消化分离切片两种。


1.  在用玻璃瓶培养细胞做透射观察时,做原位切片非常复杂。只能采用消化法把细胞制成悬液才能进行包埋和切片。其过程为:消化分离细胞、固定、包埋、切片和观察几项。

进行消化时,应注意,消化液的浓度不宜太大、消化时间也要适度,吹打细胞动作
要轻微,以防损害细胞表面的微细结构。然后低速离心,令细胞沉于离心管底部(用锥形离心管最好),吸除上清液,立即加戊二醛固定。其余包埋、切片等步骤与一般组织相同,请参阅其它电镜技术,此不赘述。


2.  单层培养细胞通过消化分离细胞包埋法的优点是获细胞数量多,便于进行包埋和切片。

缺点一是通过消化可能损伤细胞表面结构,二是消化改变了细胞单层生长时细胞相
互接壤关系。

3.  也可采用原位包埋法,为此应把细胞培养在无菌聚苯乙烯塑料薄膜上,便
于进行固定、包埋、切片处理。

聚苯乙烯薄膜是一种由聚苯乙烯制成的厚度类似盖片、
无毒、质地柔软、已消毒包装的成品(国内尚未见生产)。用时可剪切成适宜的小块置入瓶中,然后再向瓶中接种细胞,待细胞附于盖片上并生长后,取出、进行固定、剪切成小块、直接包埋入Epon胶囊中,很易切片,是原位包埋透射电镜观察细胞理想的方法。


如观察的为悬浮细胞,因悬浮细胞不必做消化处理,可直接进行离心、固定、包埋和切片,细胞保存效果好。


二、扫描观察

培养细胞扫描观察非常方便,在观察贴壁细胞时也需进行消化,制备
成细胞悬液后,用Hanks液漂洗1~2 次,除去细胞碎块和血清蛋白等(以免妨碍观察)。其余处理与血细胞扫描电镜观察法相同。


进行原位扫描观察培养细胞更为容易,可按以下步骤进行:
 

1.  加支持物小盖片培养法培养细胞,至指数增生期;


2.  PBS pH7.4漂洗两次,以去除培养液;


3.  25 %戊二醛/PBS固定30 分钟;


4.  PBS漂洗3 次;


5.  1 %OsO4固定45 分钟;


6.  PBS漂洗3 次;


7.  脱水

丙酮/醋酸异戊酯(1:1)10 分钟→醋酸异戊酯30 分钟;


8.  临界点干燥;


9.  喷金;


10.  扫描电镜观察(Hitachs-450)、照像。

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