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《Hepatology》：补充抗氧化剂抗癌？不是想吃就能吃！

2020.5.05

抗氧化剂在癌症的发生和发展中的角色越来越有争议，越来越多的证据显示不同的抗氧化剂在不同类型的癌症进程中，既有可能会起到积极的预防作用，又或者会加速癌症的发展。尽管不能全盘否认抗氧化剂在预防肿瘤方面积极的作用，该不该使用抗氧化剂以及如何使用，都给人们造成了相当的困扰。第二军医大学近日于《Hepatology》发文指出，在原发性肝细胞癌的发生进程中，靶向线粒体或非靶向线粒体的抗氧化剂具有相当不同的作用。两种类型的抗氧化剂通过影响ATM/ATR的活性，调控DNA的损伤修复，对原发性肝细胞癌的发生发展起到了截然不同的作用，为相关的药物治疗提供了新思路。本研究的RNA -seq实验部分由伯豪生物助力完成。

研究思路

研究结果

1.非靶向线粒体的抗氧化剂促进修复DNA损伤，抑制原发性肝细胞癌（HCC）的发生和发展，而靶向线粒体的抗氧化剂促进肝癌的发生和发展

通过注射DEN造成原发性肝细胞肿瘤的患病小鼠，分别饲喂两种类型，非靶向线粒体和靶向线粒体的抗氧化剂。饲喂非靶向线粒体NAC的小鼠，其肿瘤大小约为对照组的四分之一，相比而言，肿瘤生长得到了显著抑制。饲喂线粒体靶向型抗氧化剂SS31的HCC小鼠与对照组相比，肿瘤显著增大。相似的实验结果同时由另外两种抗氧化剂，线粒体靶Trolox和线粒体靶向型抗氧化剂MitoQ证实。

由DEN和CCl4共同作用造成的HCC更接近于人类病症，本研究中同时在DEN和CCl4共同作用产生的HCC小鼠模型上进行了相同的抗氧化剂处理，结果与DEN处理患病小鼠一致。

2.转录测序实验揭示两种类型抗氧化剂处理后氧化还原反应，以及DNA损伤应激反应相关基因表达量显著变化

对DEN 和CCl4共同处理造成的HCC小鼠，分别饲喂线粒体靶向和非线粒体靶向的两种类型的抗氧化剂处理后，进行转录组测序实验。与PBS处理对照组相比，GO功能分析显示，氧化还原反应相关的基因，表达量发生了显著变化，这表明小鼠体内的氧化还原反应状态可能对于HCC的发生发展起到了重要影响。RNA-seq实验揭示，差异基因在DNA损伤应激反应相关通路显著富集。NAC和SS31引起的氧化还原状态以及DNA损伤反应中很不相同。

在诸多关注的氧化还原反应相关因子中，细胞色素P450家族中的CYP4A10，CYP4A14，LBP1以及CBR1四个基因表达有显著差异，表现为经NAC处理表达量显著减少，经SS31处理表达量显著增加，测序结果通过qPCR实验验证。同时，免疫荧光试验显示，CYP4A10在经NAC处理后显著减少，而经SS31处理后，积累显著增加。

3. SS31加剧DNA损伤程度，而NAC处理促进修复DNA损伤

对DNA损伤marker 8-OHdG，以及DEN诱发产生的丙二醛（MDA）进行免疫组化实验，经SS31处理后，DNA损伤标记物显著积累，而在NAC处理后显著降低。同时，脱嘌呤或嘧啶（AP）位点在肝组织的分布经SS31以及NAC处理后也发生了显著变化。这些结果暗示了氧胁迫mtROS可能在DNA损伤中起到的重要作用。

DDR、组蛋白（H2AX）、p53结合蛋白（P53BP1）、BRCA1在DNA损伤的应激反应中都起到了关键作用，而SS31处理使这些因子的表达显著降低，NAC促进这些蛋白的表达。有意思的是，细胞凋亡和半胱氨酸蛋白酶caspase-3 和多聚 (ADP-核糖)聚合酶PARP，细胞凋亡相关因子额表达仅在NAC和Trolox处理后表达显著提升，而经线粒体靶向的抗氧化剂处理后表达无显著变化。

4. NAC和Trolox通过激活ATM/ATR，减缓DNA的损伤修复。而SS31和MitoQ会通过抑制ATM/ATR活性，加剧DNA的损伤程度

细胞中ATM和ATR的编码基因具有较高的同源性，均具有丝/苏氨酸蛋白激酶活性, 作用下游靶蛋白相应丝氨酸或苏氨酸位点。在细胞周期调控、DNA损伤识别和修复中处于关键位置。DNA发生损伤后，ATM/ATR是氧化应激反应的中心。一些因素，如DNA损伤或者ATP，会促使ATM发生自身磷酸化，处于激活状态p-ATM。

在由DEN诱发的肝细胞癌小鼠模型中，NAC和Trolox处理后，pATM/pATR表达明显上升，并且pATM/pATR的下游重要底物 p-CHK1 and p-CHK2也显著增加。相反地，经SS31处理后，，pATM/pATR表达显著下降。
不同类型的抗氧化剂对于ATM的影响，提示我们ROS产生位置的不同，可能会对DNA损伤造成不同的影响。经SS31处理后，p-ATM在线粒体内积累增加，而在细胞核中积累显著降低。相反地，经NAC处理后，p-ATM在线粒体内积累显著降低，而在细胞核中显著增加。另外，免疫荧光实验表明，NAC处理后，ATM在细胞核区域大量积累，而SS31引起ATM在线粒体周围的明显积累。

5.在体内和体外实验中，施用ATM阻断剂后，由DEN诱发的DNA的损伤情况都发生了加剧

用ATM的抑制剂VE-822阻断ATM发挥作用，由DEN诱发的DNA损伤加剧，效果与NAC处理相抵消。相反地，用ATR/ATM 激活剂能够促进修复DNA损伤，其效果与SS31处理造成的效果相抵。相一致的实验结果在由DEN诱发的肝细胞癌小鼠模型中也得到证实。

研究结论

在由DEN诱发的肝细胞癌小鼠模型中，NAC和Trolox能够通过激活ATM/ATR，减缓DNA的损伤修复。而相反地，SS31和MitoQ会通过抑制ATM/ATR活性，而加剧DNA的损伤程度。当部分恢复由SS31清除的线粒体ROS后，SS31引起的DNA损伤也会得到缓解。不同类型抗氧化剂对HCC造成的相反的影响，可能的解释是，是由线粒体和非线粒体产生的ROS在肝癌发生初始时期的发挥的作用不同，线粒体内产生的不平衡ROS可能会诱发基因毒素引起的基因损伤，进而造成肿瘤的生成。

原文出处
Wang B, Fu J, Yu T, Xu A, Qin W, Yang Z, Chen Y, Wang H. Contradictory effects of mitochondria- and non-mitochondria-targeted antioxidants on hepatocarcinogenesis by altering DNA repair. Hepatology. 2017.

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