WB检测中二抗的选择方法
二抗选择
二抗是用一抗免疫动物制备的抗一抗的抗体，选择范围较窄，基本是商品化的，在不考虑二抗修饰类型的前提下，二抗的选择需要遵循以下原则：二抗来源种属、一抗来源种属和抗原来源种属互不相同。例如如果研究对象是人的蛋白X，选择了鼠抗X一抗，则可选择兔抗鼠二抗或者羊抗鼠二抗。
二抗选择要考虑的问题有：
①对单抗类一抗，二抗需与一抗的类别或亚类相匹配（多抗类一抗主要是IgG类免疫球蛋白故相应二抗就是抗IgG抗体，不作考虑）。
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一抗类别或亚类 |
二抗 |
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IgM |
抗IgM |
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IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3 |
抗IgG、抗IgG1、抗IgG2a、抗IgG2b、抗IgG3 |
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未知 |
抗IgG |
②某些组织或细胞含有较多的Fc受体，如脾脏、淋巴细胞等，此时二抗需要选择抗IgG F(ab’)2二抗，避免各种Ig保守结构域导致的交叉反应。然而各种Ig仍具有保守的轻链结构域，因此还是有一定程度的交叉反应。
WB检测之内参抗体
Western Blot检测方法不仅能检测靶蛋白存在与否，还能比较不同条件下或者不同组织中靶蛋白的相对表达量，可作为蛋白表达水平最直接的证据。在WB实验中有众多不确定因素影响靶蛋白表达水平的测定，如方法学本身性质、操作误差等。为准确衡量靶蛋白表达水平，需要精确一致的上样量，使用内参的意义即是保证上样量的一致。内参即内部参照（Internal Control），对哺乳动物细胞一般指管家基因的表达蛋白(Housekeeping Proteins)。此类蛋白在各组织和细胞中的表达相对恒定，可作为检测蛋白表达水平变化的参照物。当内参条带亮度基本一致时，基本可以确定上样量是一致的，通常采用比较靶蛋白和内参蛋白条带亮度比值来进行相对定量。
WB实验中涉及到的蛋白-抗体结合是一个复杂的活性生物大分子间的相互作用，众多因素都会影响实验的结果。例如时间、温度、浓度、离子强度等，在实验设计时就需要有严谨的对照方案，通过对照就容易判断问题所在，严谨的WB实验中需要设立蛋白分子量标准、空白载体对照、未诱导对照、已知量标准物正对照和内参。
内参使用方法
1.标记内参：酶标的内参抗体可避免二抗结合总蛋白中某些免疫球蛋白产生的杂带，使用时只需在二抗孵育时加入酶标内参抗体，按照正常操作即可。
2.普通内参：当靶蛋白分子量与所选内参分子量相差不大时，可先对靶蛋白进行显色检测，然后用Strip缓冲液洗掉膜上抗体，重新对内参蛋白进行显色检测。当靶蛋白分子量与所选内参分子量相差较明显时，可对转膜预染，根据蛋白质分子量将膜剪为两部分并分开进行靶蛋白和内参蛋白的显色检测。
内参抗体选择
常用的蛋白内参有GAPDH和β-actin或β-tubulin，内参的选择原则是选择与靶蛋白分子量相差5KD以上的内参，对不同的样本则需要根据实际情况进行选择。
1.根据物种选择
哺乳动物来源的组织或细胞样本通常选择β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、Na+/K+-ATPase等。植物来源的样本常选择plant actin、Rubisco等。对于其他研究稀少的物种可参考报导的文献进行选择。以GAPDH为例，抗GAPDH单抗（ABGENT，clone 6C5）能够与非洲蟾蜍、猴、猪、羊、狗、猫、鱼、蛙、鸡、兔、小鼠、大鼠及人组织来源的GAPDH反应，但不能与酵母GAPDH反应。
2.根据组织类型选择
以肌动蛋白actin为例，肌动蛋白actin在不同物种之间高度保守，且同一物种不同类型actin的序列相似性大于90%，使其很难获得特异性较好的抗actin抗血清。但同一物种不同类型actin的N段序列相似性仅50~60%，故N端序列常被用来制备抗actin的抗体。脊椎动物肌动蛋白分为α、β和γ三种类型，α型分布于心肌、横纹肌细胞和平滑肌细胞中，γ型分布于平滑肌细胞和非肌细胞中，β型分布于非肌细胞中，共六种actin蛋白。不同厂商生产抗β-actin抗体过程中选择的免疫区段在不同型actin之间的保守与否影响到抗体的组织特异性。选用β-actin N端的16个氨基酸序列制备的单多抗占大多数，这类抗体均不能检测心肌和横纹肌中的actin条带。选用β-actin C端16个氨基酸序列制备的抗体则可以在肌肉细胞中检测到actin的信号。
3.根据蛋白组分选择
提取细胞蛋白组分过程中，胞浆蛋白通常是最先提取出来的。离心全细胞裂解液所得的上清含胞浆蛋白，而沉淀含胞核蛋白和胞膜蛋白，继续加大裂解程度即可提取到胞核蛋白，最后才能提取到胞膜蛋白。通过特殊的方法还可以从胞浆蛋白中提取到线粒体蛋白、叶绿体蛋白等。针对不同的细胞组分需要选择不同的内参抗体。
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类目 |
内参 |
观测分子量 |
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细胞总蛋白 |
GAPDH |
36 kDa |
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β-actin |
42kDa |
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β-tubulin |
55kDa |
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胞膜蛋白 |
Na+/K+-ATPase |
100kDa |
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Integrin |
90-160kDa |
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胞浆蛋白 |
caveolin-1 |
20-24kDa |
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Actin |
42kDa |
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Tubulin |
50kDa |
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线粒体蛋白 |
VDAC1 |
35-37kDa |
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COX IV |
17kDa |
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胞核蛋白 |
Lamin A |
65 kDa,70kDa |
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Lamin B |
66-70kDa |
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Histone H3 |
18kDa |
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PCNA |
36kDa |
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laminA/C |
74kDa |
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Caveolin |
20-24kDa |
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TATA binding protein |
鼠源：33-36kDa 人源：37-43kDa |
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Pax-5 |
45kDa |
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Rb |
110kDa |
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c-Jun |
43 kDa,48kDa |
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c-Fos |
62kDa |
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nucleoporin p62 |
61kDa |
在选择细胞总蛋白内参时，GAPDH、β-actin、tubulin三种内参同时发生变化的情况很少。如出现这种情况，可用胞核内参甚至线粒体内参代替。另外，不同的实验目的应选择不同的内参，例如检验质核分离效果应选择胞浆蛋白内参actin，抽提的核组分中检测不到actin则表示质核分离效果较好。
总之，内参的选择要根据实际情况而定，不仅要考虑到物种、组织、组分等因素，还需要考虑到实际的实验设计。如实验设计中包括组织缺氧、糖尿病等因素变量，则不适宜选择GAPDH作内参，研究细胞增殖的相关实验中则不适宜选择c-Jun作内参，在凋亡实验中则要避免使用TBP、Lamin等。
