ELISPOT 实验方案 

对应BD的试剂盒 
实验材料的准备 
试剂盒中没有但是必须的 
材料:   
• 已消毒的移液器 (Gilson)。单道20ul,100ul,200ul,1ml, 8/12道200ul 
• 无菌一次性聚苯乙烯吸量管 (1ml, 5ml, 10ml）(Axygen)。 
• 一次性乳胶手套 。 
• 无菌一次性离心管（15ml、50ml）(Corning cat#430052 and 430290)。 
• 吸水纸(卫生纸) 
• 无菌tip头, 200ul,1ml, 

    试剂: 
1.        PBS 无菌 300ml/10板，有菌4000ml/10板 在准备包被抗体时不要使用商业化的PBS 
2.        ddH2O(无菌) 对于10块ELISPOT板，200 ml 
3.        有菌洗涤缓冲液(PBST)：有菌3000ml/10板 
Tween-20 进口 
4.        有菌洗涤缓冲液(PBS)：有菌1000ml/10板 
5.        培养液：无血清培养基 （P/S, 2 mM 的谷氨酰胺，以及 Hepes buffer）。 
6.         PMA ＋ionomycin. 
    Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA; Sigma Chemical Co., product nr. P8139 is recommended). 
PMA  
贮 存 液：PMA溶于DMSO，浓度为1mg/ml，-20℃保存 
工 作 液：贮存液 1:4000稀释于无血清培养基中 
此时为 250ng/ml  
 Calcium ionophore (ionomycin; Sigma Chemical Co, product nr. I0634 is recommended). 
Ionomycin  
贮 存 液：Ionomycin溶于DMSO，浓度为1mg/ml，-20℃保存 
工 作 液：贮存液 1:200稀释于无血清培养基中 
此时为 5μg/ml  
50ml混合刺激剂＝PMA工作液12.5ul，Ionomycin工作液250ul，无血清培养基补齐 


7.        10% 热灭活胎牛血清 (Hyclone cat# ALH14384 ) 
8.        抗原 
      
设备: 
• 洗板器: 自动或手动 (洗瓶, 手动分液器等)。 
•专用CO2-细胞培养箱 (37°C)。 
4°C冰箱 
无菌间无菌操作台 



Preparation kit reagents   
1．包被用抗体 
取50 μl加到10ml PBS中。（足够包被1块96孔板，100 μl/well）。 
对10块板子， 500ul加到100ml PBS中 
2．生物素标记的检测抗体（detector antibody） 
取50μl加到10 ml  Dilution buffer中。（混匀后加入ELISPOT板，100 μl/well）。 
对10块板子， 500ul 加到100ml Dilution buffer(PBS+10%FBS) 
3．STREP-HRP 
取100μl加到10 ml  Dilution buffer中。（混匀后加入ELISPOT板，100 μl/孔）。 
对10块板子， 1ml 加到100ml Dilution buffer 

4 显色激活系统（Activation system） 
对于1块ELISPOT板，200ul AEC Chromogen + 10 ml AEC Substrate，混匀，10分钟内用完。（100 μl/孔）。 

ELSPOT实验步骤 
Day 1  
包被ELISPOT板 16：30 

1.        在ELISPOT板中每孔加入包被抗体100μl，4℃ 过夜。 
Day 2 
ELISPOT板的封闭  17：00 

2.        取出已包被的ELISPOT板，吸弃每孔中的包被抗体溶液。 
3.        用完全无血清培养基洗1次。 
4.        在ELISPOT板中，每孔加入200μl完全无血清培养基。室温2h。(8道排枪) 
5.          
PBMC加入ELISPOT培养板 20：00