用固化 Ni2+吸收色谱纯化带组氨酸标签的蛋白实验
实验材料 表达带多聚组氨酸标签的蛋白的大肠杆菌细胞
试剂、试剂盒 结合缓冲液咪唑洗脱缓冲液TritonX-100洗涤缓冲液SDS-聚丙烯酰胺凝胶
仪器、耗材 Sorvall SS-34 转头或相当的转头层析柱固化 Ni2+层析树脂摇床
实验步骤
材料
缓冲液和溶液
贮存液、缓冲液和试剂的成分参见附录 1。
贮存液稀释至适当浓度。
结合缓冲液（pH7.8)
20 mmol/L 磷酸钠
500 mmol/LNaCl
咪唑洗脱缓冲液（pH6.0)
20 mmol/L 磷酸钠
500 mmol/LNaCl
在洗涤缓冲液（pH6.0) 中加入适量 3mol/L 咪唑分别配成 10 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L 和150 mmol/L 的咪唑洗脱缓冲液。
TritonX-100(10%V/V)
洗涤缓冲液（pH6.0）
20 mmol/L 磷酸钠
500 mmol/LNaCl
酶和缓冲液
DNase(1 mg/ml)
溶菌酶
RNase（1 mg/ml)
凝胶
SDS-聚丙烯酰胺凝胶（10%）
用于分离蛋白的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备参考附录 8。
离心机和转头
Sorvall SS-34 转头或相当的转头
特别配备
层析柱（玻璃或聚丙烯）
固化 Ni2+层析树脂（如 ProBond,Invitrogen 公司；HisTrap,Pharmacia 公司；His.Bind Resin,Novagen 公司；NTA-Ni2+-琼脂糖，Qiagen 公司）
目前最常用的金属螯合亲和载体是次氨基兰乙酸酯（NTA)-Ni2+-琼脂糖，可从上述公司购买，另外还有不同性质的其他载体。据说一种独特的 Co2+螯合物（Talon) 对 His-6 的亲合力更高，选择性也更强,但在实验室再生不方便. 因此成本也就更高。
摇床
载体和细菌菌株
表达带多聚组氨酸标签的蛋白的大肠杆菌细胞（方案 1、2、3 或 4 产生）。
方法
Ni2+亲和柱的制备
1. 轻轻颠倒混匀固化 Ni2+树脂，取 2 ml 装入层析柱，树脂自然沉降。
2. 用 3 倍柱体积的无菌水冲洗树脂。
树脂沉降后的体积为 1 个柱体积。
3. 用 3 倍柱体积的结合缓冲液（pH7.8) 平衡树脂，放置待第 9 步使用。
制备细胞抽提物
4. 每 100 ml 细胞培养物的细胞沉淀（方案 1 步骤 17) 悬于 4 ml 结合缓冲液（pH7.8)。
5. 加入溶菌酶至终浓度 1 mg/ml, 冰上放置 30 min。
有些方案中在亲和纯化带组氨酸标签蛋白之前，采用超声或 French 压的方法裂解细胞。使用溶菌酶的方法重复性更好，而且不会引起细胞的灾难性裂解，后者释放外膜蛋白和能引起带组氨酸标签蛋白聚集的其他分子。
注意：可以加入蛋白酶抑制刑，但不能加入 EDTA 或其他螯合剂，因为它们会将 Ni2+从树脂上带下来. 破坏树脂对组氨酸的亲合力。
6. 混和物于 4°C 摇床上孵育 10 min。
7. 加入 Triton X-100、DNase 和 RNase, 终浓度分别为 1%、5ug/ml 和 5ug/ml，再于 4°C 摇床上孵育 10min。
8.4°C 3000 g(5000 r/min Sorvall SS-34 转头）离心 30 min, 去除不溶性细胞碎片。上清（细胞裂解物）转移到一只新管中。
为防止纯化过程中树脂被堵塞, 上淸需要用 0.45 滤膜过滤。
纯化带组氨酸标签蛋白
9. 树脂上的结合缓冲液引流到柱顶部。
10. 步骤 8 获得的细胞裂解液上清上柱，流速调整为每小时 10 个柱体枳。
1 ml Ni2+亲和树脂能结合大约 8~12 mg 蛋白。带多聚组氨酸标签的蛋白在大肠杆菌中的产量因靶蛋白而异，但一般都在每 100 ml 培养物蛋白之间 。
11. 用 6 个柱体积的结合缓冲液（pH7.8) 洗柱。
12. 用 4 个柱体积的洗涤缓冲液（pH6,0) 洗柱，直至流过液 A280<0.01。
13. 用 6 个柱体积的 10 mmol/L 咪唑洗脱缓冲液洗脱结合的蛋白，每份 1 ml 分步收集，监测 A280。
14. 用咪唑浓度更高（50 mmol/L、100 mmol/L 和 150 mmol/L) 的洗脱缓冲液重复步骤 13。
也可用 10~100 mmol/L 连续梯度咪唑洗脱缓冲液洗脱结合的蛋白，多数组氨酸标签蛋白在 50~100 mmol/L 之间被洗脱。如果不使用咪唑，还可以用 pH 递降的缓冲液洗脱（请参考替代方案：用 pH 递降的缓冲液从金属亲和柱洗脱多聚组氨酸标签蛋白）。
15. 用 20ul 等份的蛋白进行 10%SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析聚组氨酸标签蛋白的分布。
