实验概要

转印到纸上的蛋白质抗原，可与其专一性抗体结合，再以二次抗体-酶结合体(2nd Ab-HRP) 或Protein A-HRP 呈色；可在一群转印色带中，专一性地挑出目标蛋白质，是最有用的检定工具。

主要试剂

1. 抗体溶液：可用传统抗血清或单株抗体，其最适使用浓度，随抗体效价不同而异，以下为一般适用范围的参考，均以明胶-NET 稀释的。

   1) 传统抗血清：1:100 到1:1，000

   2) IgG (冷冻干燥品)：10~50 μg/mL

   3) 单株抗体 (小白鼠腹水) ：1:200到1:5，000

   4) 单株抗体 (细胞培养液)：原液或1:10明胶-NET：用来稀释抗体溶液或酶联体明胶gelatin (Merck 4070，0.25%) 5.0 gm；NaCl (0.15 M) 17.5 gm；EDTA (5 mM) 3.6 gm；Tween-20 (0.05%) 1.0 mL；Tris (Tris base，50 mM) 12.1 gm加热溶解于1800 mL 纯水后pH 调到8.0，再加水到 2000 mL。

2. 酶联体：

可使用2nd Ab-HRP 或Protein A-HRP，使用浓度每家商品不同，约为1:1000到1:5000 的间，以明胶-NET 稀释的。

3. PBST 洗液

4. DAB 基质溶液：DAB (diaminobenzidine，Sigma D-5637) 5 mg溶于100 mL Buffer A-0，再加10 μL H₂O₂，新鲜配制，避光贮存。 DAB为致癌物质，称量时勿吸入DAB 细尘，并小心处理秤量纸。

实验步骤

1. 尿素洗过夜的转印纸再以10 mL PBST 洗三次，每次约10 min，均在上述方形培养皿中进行。

2. 转印纸放在明胶NET 溶液中反应，置室温中反应1h。一般使用方形培养皿当容器，但亦可装入塑料袋中反应，较节省试剂用量。

3. 反应后，以PBST 浸洗二次。

4. 把转印纸放在抗体溶液中反应，置室温反应1h。

5. 反应后以PBST 洗三次，改用酶联体反应，在室温下反应1h。

6. 以PBST洗四至五次，注意容器也要洗干净。

7. 加入DAB 基质溶液约10 mL 呈色，尽量避光，并且不时摇动呈色液。

8. 数分钟内可呈色，在背景加深前倒去DAB，以水冲过数次后晾干。