高耐庆大霉素肠球菌耐药性接合转移试验的方法探讨-2
表 3 HLGR 供体菌株及结合子的药敏试验结果
抗菌药 | 供体菌（ 36 株） | 结合子（ 36 株） | ||
耐药菌株数 | 耐药百分率（ % ） | 耐药菌株数 | 耐药百分率（ % ） | |
庆大霉素 | 36 | 100 | 36 | 100 |
链霉素 | 21 | 58 | 17 | 47 |
青霉素 | 11 | 31 | 1 | 3 |
氯霉素 | 20 | 56 | 13 | 36 |
氨苄西林 | 9 | 25 | 1 | 3 |
红霉素 | 35 | 97 | 27 | 75 |
四环素 | 29 | 81 | 28 | 78 |
合计 | 36 | 36 |
4 ． PCR 耐药基因检测 在 36 株粪肠球菌及 14 株屎肠球菌供体菌及所形成的结合子中均检测到了 aac( 6' )-aph( 2 ” ) 基因。
表 4 36 株粪肠球菌及结合子耐药谱
菌株 编号 | 转移前供体菌 | 转移后结合子 | ||||||||||||
抗菌药 | 抗菌药 | |||||||||||||
Sm | Gm | Pen | Chl | Tet | Amp | Ery | Sm | Gm | Pen | Chl | Tet | Amp | Ery | |
1 | R | R | R | R | R | R | R | R | R | R | R | R | ||
2 | R | R | R | R | R | R | R | R | R | |||||
3 | R | R | R | R | ||||||||||
4 | R | R | R | R | R | R | R | R | R | |||||
5 | R | R | R | R | R | R | R | R | R | |||||
6 | R | R | R | R | R | R | R | R | R | |||||
7 | R | R | R | R | ||||||||||
8 | R | R | R | R | R | R | R | |||||||
9 | R | R | R | R | R | R | R | R | ||||||
10 | R | R | R | R | R | R | R | R | R | R | ||||
11 | R | R | R | R | R | R | R | |||||||
12 | R | R | R | R | R | R | R | R | R | R | ||||
13 | R | R | R | R | R | R | R | R | ||||||
14 | R | R | R | R | R | R | ||||||||
15 | R | R | R | R | R | R | R | R | R | R | ||||
16 | R | R | R | R | R | R | R | R | R | |||||
17 | R | R | R | R | R | R | R | R | ||||||
18 | R | R | R | R | R | R | R | R | ||||||
19 | R | R | R | R | R | R | R | R | R | R | ||||
20 | R | R | R | R | R | R | R | R | ||||||
21 | R | R | R | R | R | R | R | R | R | R | ||||
22 | R | R | R | R | R | R | R | R | ||||||
23 | R | R | R | R | R | |||||||||
24 | R | R | R | R | ||||||||||
25 | R | R | R | R | R | R | R | |||||||
26 | R | R | R | R | R | R | R | R | ||||||
27 | R | R | R | R | R | R | R | R | ||||||
28 | R | R | R | R | R | R | R | |||||||
29 | R | R | R | R | R | R | R | R | R | |||||
30 | R | R | R | R | R | R | R | R | R | R | ||||
31 | R | R | R | R | R | R | R | R | R | R | R | |||
32 | R | R | R | R | R | R | R | |||||||
33 | R | R | R | R | ||||||||||
34 | R | R | R | R | R | R | R | R | ||||||
35 | R | R | R | R | ||||||||||
36 | R | R | R | R | R | R | R | R | R |
注：“ R ”耐药
讨 论
本次试验中分离到的 36 株 HLGR 粪肠球菌，全部多重耐药。对红霉素的耐药率最高 (97 ％ ) ，四环素次之 (81 ％ ) ，链霉素和氯霉素分别为 58 ％和 56 ％，氨苄西林与青霉素的耐药率相对较低。实验所选的 7 种抗菌药物中，所有菌株对三种或三种以上抗生素耐药， 47 ％的菌株对五种及五种以上抗菌药物耐药。 100 ％的粪肠球菌将 HLGR 的耐药性转移到了受体菌 JH2-2 ，并伴有其他耐药性的同时转移，大多数抗菌药的耐药性都可通过接合方式转移到受体菌，氨苄西林与青霉素的耐药性转移也远低于其他抗菌药。但伴随四环素、红霉素、链霉索耐药性转移的比例较大，而针对青霉素、氨苄西林的耐药性同时转移的比例较小。可见，庆大霉素、链霉素、红霉素、四环素的耐药基因位于同一个接合型转移单位的机率大于青霉素、氨苄西林的耐药基因。
通过试验证明接合转移是肠球菌耐药性转移的重要方式，接合转移试验是研究肠球菌耐药性转移的重要方法。
根据文献报道 [6] 信息素应答质粒可在肉汤 ( 液体 ) 中有效转移，其主要存在于粪肠球菌中。通过普通肉汤、普通肉汤加马血清、 BHI 、 BHI 加马血清四种培养基作为接合反应前、接合反应中的培养基的比较，发现普通肉汤作为培养基时转移通过率 (50 ％ ) 最低．而普通肉汤加马血清、 BHI 或 BHI 加马血清作为培养基时转移通过率相对提高，分别为 75 ％、 89 ％。实验结果证明，按合效率随营养条件的改善而提高，但在营养较充足时，转移效率便不再受之影响。在接合反应过程中使反应体系保持适当的振动，可以使肠球菌分散均匀，增加潜在供体菌与受体菌的接触机会，提高结合效率。接合反应结束时，适当离心，取沉淀反应物转入选择培养基，以防止转移频率过低时，所取菌液中不含结合子。
在供体菌与形成的结合子中均检测到了 aac( 6 ' ) — aph( 2 ” ) 基因，证明接合转移试验方法可靠。
对于非信息素应答质粒、接合性转座子的接合反应，在液体中很难转移，一般需在固体表面进行，如滤膜接合法。 15 株屎肠球菌肉汤接合试验虽然没有成功，但滤膜接合试验却有 14 株转移成功。同时， 4 株粪肠球菌在肉汤中未转移的质粒也都通过滤膜接合法转移成功。滤膜为接合反应的细菌提供了稳定、持久的接触表面，促进了接合反应的进行。
无论是通过肉汤接合法，还是滤膜接合法， HLGR 及 VER 的耐药性都未能从肠球菌转移至表皮葡萄球菌 S386 和金黄色葡萄球菌 S1106 ，有可能转移较困难，仍需做进一步的试验进行观察。但近年的研究表明，肠球菌中的多种耐药性来自于葡萄球菌属。
参考文献
1. N.Kobayashi,Md.Mahbub Alam,Y.Nishimoto,et al.Distribution of aminoglycoside resistance genes in recent clinical isolates of enterococcus faecalis,Enteroccus faecium and Enterocccus avium.Epidemiol.infect.2001,126 ： 197-204
2. Dunny, G.M.R.A.Craig,R.L.Carron,and D.B.Clewell. Plasmid transfer in Streptococcus faecalis ： production of multiple sex pheromones by recipients.Plasmid.1979,2 ： 454-465.
3. Werner G,Willems RJ,Hildebrandt B,et al, Influence of transferable genetic determinants on the outcome of typing methods commonly used for Enterococcus faecium.Journal of Clinical Microbiology.2003,41 ： 1369-1506.
4. 卢圣栋主编 . 现代分子生物学实验技术 . 第二版 . 中国协和医科大学出版社， 1999 ； 109-115.
5 ． Swenson JM,Ferraro MJ,Sahm DF,et al. Multilaboratory evaluation of screening methods for detection of high-level aminoglycoside resistance in enterococci. National Committee for Clinical Laboratory Standards Study Group on Enterococci.J Clin Microbiol. 1995,33 ： 3008-18.
6. Wirth R.Sex pheromones and gene transfer in Enterococcus faecalis.Res Microbiol.2000 ， 151 ： 493-6.
