双向电泳的操作步骤

第一向等电聚焦

⒈ 从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液（I）（不含DTT，不含IPG buffer）一小管（1ml/管），置室温溶解。

⒉ 在小管中加入0.01g DTT， 0.5% 对应胶条pH范围的IPG buffer，充分混匀。

⒊ 从小管中取出400微升水化上样缓冲液，加入100微升样品（考马斯亮蓝染色需样品1mg，银染需300μg），充分混匀。

⒋ 从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条，室温中放置10分钟。

⒌ 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。

⒍ 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。

⒎ 分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。

⒏ 在每根胶条上覆盖1-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。

⒐ 对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。

⒑聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存。

第二向SDS-PAGE电泳

⒈ 装配灌胶模具，配制10%的丙烯酰胺凝胶两块。配200ml凝胶溶液，每块凝胶50ml，将溶液沿灌胶模具背面槽道倒入，直至溶液到距离玻璃板1cm停止，用75%乙醇或水饱和正丁醇封面，保持胶面平整。聚合30分钟后，凝胶与上方液体分层，表明凝胶已基本聚合，建议聚合3-5h使凝胶完全聚合。

⒉ 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗。

⒊ 从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10分钟，使其恢复至室温。

⒋ 配制胶条平衡缓冲液I（含DTT）。

5．在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。

⒍ 将胶条转移至平衡管或溶胀盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入5-10ml胶条平衡缓冲液I。将平衡管或溶胀盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。

⒎ 配制胶条平衡缓冲液Ⅱ（含碘乙酰胺）。

⒏ 第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。再加入胶条平衡缓冲液Ⅱ，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。

⒐ 用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。

⒑将低熔点琼脂糖封胶液进行加热溶解。

⒒将10×电泳缓冲液，用量筒稀释10倍，成1×电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。

⒓第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液Ⅱ。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。

⒔将IPG胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。

⒕将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。

⒖用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时，要注意是推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。

⒗放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。

⒘在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。

⒙在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低功率（1W/gel/18-24cm）或低电压，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（或电压）（13-15W/gel/18-24cm），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。

⒚电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。

⒛进行染色。