【求助】关于做蛋白表达正向引物和反向引物需不需要加...

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• zhenxin (2014-5-31 17:14:32)

  
  可作如下考虑：
  1. 如果载体上MCS前有ATG，你的目的基因是否与其同框？
  2. 如果载体上MCS前没有ATG，你的目的基因必须有自己的ATG和SD序列。切记，SD序列非常重要，我就有同学一直表达不出来，后来发现是酶切时切掉了SD序列，核糖体结合不上，当然不能翻译了。
  3. 表达的蛋白是否有毒性，毒性蛋白会抑制宿主菌生长的。
  针对你的问题暂时想到这些，当然还有载体、宿主菌及表达条件多方面的因素需考虑，这及很泛了，不好分析。总之蛋白表达是个很综合的问题，好好设计一下吧，祝你顺利！

• 雪原 (2014-5-31 17:14:54)

  仔细又看了表达不成功的两个载体，载体pet28a和prset在多克隆位点前都有起始密码子ATG,在ATG前面都有RBS，所以按道理我要表达的目的基因序列不加ATG也是可以的啊？？不解。
  另外“常春藤下的猫”说“目的基因是否与其同框是“啥意思？
  我还没有发现载体MCS前没有ATG的，看了pqe30,pqe40,pet32a,pet28a,prset的MCS前都是有ATG的，那是不是表达时引物都不需要加ATG了？若需要加ATG的话，还要加什么SD序列吗？这么复杂？

• zwsyrt (2014-5-31 17:15:35)

  
  不需要加了，载体本身有的干吗多此一举。
  蛋白不表达有很多原因，又不光光是你说的那几种。
  我看关键是你的外源基因的问题。
  实在不好表达就作融合吧，会好一点。

• nn255 (2014-5-31 17:16:30)

  做表达有一两个月了，前后用了两个载体（pet28a和prset)，同时做了好几个片段都没有表达，由于所选用的酶切位点都是Hind3和BamH1，所用的引物都是一样的，刚开始用pet28a时不表达怀疑是由于表达菌株BL21(DE3)不提供稀有密码子翻译的原因，后来用prset/BL21(DE3) plysS还是不表达，让我郁闷的不行了，以前用过pet32a/Rosetta-gami(de3)表达过一段序列有表达出来，现在实在是搞不明白怎么弄都不表达，前后的区别就是我第一次表达成功的那次是在上游引物加了起始密码子ATG和下游的终止密码子，后面表达不成功的两次上游引物和下游引物都没有加起始密码子和终止密码子，我现在就不是不明白是不是一定要在表达的序列前加上一个起始密码子和下游的终止密码子？我看表达载体在多克隆位点前都有起始密码子ATG啊，应该是可以表达的啊？？问过一些人，有说pet32a表达需要加起始密码子pqe40表达载体不需要加起始密码子的，真的是这样的吗？从表达载体的序列观察不可以决定是否需要添加起始密码子吗？毕业需要，文章需要，时间比较紧迫，已经浪费不起了，写的有些罗嗦，希望园里前辈有人能给我明确的答复？万分感谢。等待答复中。。。
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  我觉得是否需要在N端自带起始密码子，关键是看你是否需要N端的标签蛋白。而C端的终止密码子建议还是在设计引物时加上为好。我最近表达的一个蛋白就出现了你这种情况，又重新设计了带有终止密码子的引物后才得以解决。
  再有就是确定已经获得了重组表达质粒（我觉得PCR法最为可靠）。
  这也是我的一些经历，对错还不敢说。但终归有些参考价值。
  祝好运！

• 雪原 (2014-5-31 17:16:54)

  
  我最开始做表达时是用pet32a做的融合表达其中一段序列制备多抗，也很顺利的表达出来了，现在主要是想获得活性表达验证其一些功能，我的目的基因是一胞外蛋白酶，考虑到pet32a表达出来的是包涵体另外还加了一个19kd的融合标签，可能会对活性有影响，就换用pet28a和prset来尝试，发现非常的棘手，现在也不知道该何去何从了，难道我要从新在上下游引物上加上ATG和TGA以防万一？我担心到最后一步诱导结果还是不表达的话，我真的会疯掉的～
  谢谢各位的热心～

• 49888 (2014-5-31 17:17:16)

  向各位大侠求救。
  我要表达的蛋白是鱼类的一种激素，主要用于制备多克隆抗体。载体用的是Pqe30，用Sph1和Pst1双酶切构建重组质粒，测序结果表明插入片段与已经报道的该基因的开放阅读框序列仅一个碱基的差异，但编码的氨基酸不变（插入片段从起始密码子ATG开始，终止密码子结束）。37度、起始OD600 0.8、1mM IPTG、200rpm条件下诱导4个小时，总蛋白做SDS-PAGE检测，没有表达，我不知原因何在。朋友告诉我，原因可能与插入片段含信号肽序列有关，是这样的吗？

• huifeng0516 (2014-5-31 17:18:36)

  我最开始做表达时是用pet32a做的融合表达其中一段序列制备多抗，也很顺利的表达出来了，现在主要是想获得活性表达验证其一些功能，我的目的基因是一胞外蛋白酶，考虑到pet32a表达出来的是包涵体另外还加了一个19kd的融合标签，可能会对活性有影响，就换用pet28a和prset来尝试，发现非常的棘手，现在也不知道该何去何从了，难道我要从新在上下游引物上加上ATG和TGA以防万一？我担心到最后一步诱导结果还是不表达的话，我真的会疯掉的～
  谢谢各位的热心～
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  呵呵，对你的心情表示理解。
  结果无非有二:
  一 瞻前顾后，停顿不前，着急；
  二 做最后一搏，实验这东西，不试永远不知道会是什么结果。
  To be, or not to be。
  that is the question。
  good luck!

• 雪原 (2014-5-31 17:19:15)

  
  仔细再研究了一下问题可能出现的地方，发现了我两次失败的表达所用的载体pet28和prset都是在不清楚确切序列的情况下就设计了引物进行表达的，也就是说，我用的pet28有pet28a,pet28b,pet28c三种，各自相差一个碱基，而prset也有prsetA,prsetB,prsetC三种，各自相差一个碱基，很不幸我设计的引物造成了移码，所以没有表达。问题发现了，下一步准备在引物上加一两个碱基避免移码，而加不加ATG和TGA我看关系不大，具体看实验要求而定。
  再次谢谢各位～

• plaa (2014-5-31 17:21:55)

  我要表达的蛋白是鱼类的一种激素，主要用于制备多克隆抗体。载体用的是Pqe30，用Sph1和Pst1双酶切构建重组质粒，测序结果表明插入片段与已经报道的该基因的开放阅读框序列仅一个碱基的差异，但编码的氨基酸不变（插入片段从起始密码子ATG开始，终止密码子结束）。37度、起始OD600 0.8、1mM IPTG、200rpm条件下诱导4个小时，总蛋白做SDS-PAGE检测，没有表达，我不知原因何在。朋友告诉我，原因可能与插入片段含信号肽序列有关，是这样的吗？
  原核表达中通常是不能带信号肽序列的。