总RNA提取常见问题分析

2019年8月02日 23:35:39 来源: 生物在线
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Q:RNA降解   
A:
1. 新鲜细胞:如果试剂没有问题,且外源性污染也可以排除,那么降解几乎都来自裂解液的用量不足。如  果将裂解液直接加入培养皿中裂解细胞,一定要使裂解液能覆盖住细胞。 
2. 新鲜组织:某些富含内源核酸酶的样品(如肝脏,胸腺等),即使使用电动匀浆器匀浆也不能避免RNA的降解。更可靠的方法是:在液氮条件下将组织研碎,并且匀浆时使用更多裂解液。
3. 冷冻样品:样品取材后应立即置于液氮中速冻,然后移至-70℃冰箱保存。样品决不能未经液氮速冻而直接保存于-70℃冰箱中。冷冻样品,即使是冷冻细胞,如果不在液氮条件下研磨碎,而直接加入裂解液中匀浆,RNA也比新鲜样品更容易降解。样品在与裂解液充分接触前决不能出现融化,所以研磨用具必须预冷,在碾磨过程中要及时补充液氮。样品研碎后,在液氮刚刚挥发完时,将样品迅速转移到含裂解液的容器中,立即混匀匀浆。
4. 外源RNA酶的污染:试剂,器械及实验环境中的RNA酶进入实验系统。
5. 内源RNA酶的污染:抑制剂失效或者用量不够,实验样品过多;匀浆时温度过高。

Q:OD260/OD280比值偏低
A:
1. 蛋白质污染:确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量,确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀,并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低,则用氯仿重新抽提一次,再沉淀,溶解。
2.苯酚残留:确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀,并且离心分层的离心力和时间要足够。
3.多糖或多酚的残留:一些特殊的组织和植物中,多糖、多酚含量较多,这些残留也会导致OD260/OD280比值偏低。因此,从这类材料中提取RNA时,需要注意多糖、多酚杂质的去除。
4.设备限制:测定OD260及OD280数值时,要使OD260读数在0.1-0.5之间。此范围线性最好。用水稀释样品:测OD值时,对照及样品稀释液请使用10mM Tris,pH7.5。用水作为稀释液将导致比值偏低。

Q:RNA提取得率低
A:
1. 该组织或者细胞中RNA含量偏低:不同细胞和组织中RNA的丰度不同,如肝脏,胰腺,心脏等是高丰度组织(总RNA含量2-4μg/mg),脑,胚胎,肾脏,肺,胸腺,卵巢等是中丰度组织(总RNA含量0.05-2μg/mg),膀胱,骨,脂肪等是低丰度组织(总RNA含量<0.05μg/mg)。
2. 组织起始量太少或者太多:样品量过少,则细胞组织中RNA含量较低;样品量过多则可能超过裂解液的裂解能力,裂解将不完全,从而导致RNA得率低。

质粒DNA提取常见问题分析

Q: 未提出质粒或质粒得率较低,如何解决?
A:  
1. 大肠杆菌老化:请涂布平板培养后,重新挑选新菌落进行液体培养。
2. 质粒拷贝数低:由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低,可更换具有相同功能的高拷贝数载体。             
3. 菌体中无质粒:有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在,经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如,柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定,因此不要频繁转接,每次接种时应接种单菌落。另外,检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。
4. 碱裂解不充分:使用过多菌体培养液,会导致菌体裂解不充分,可减少菌体用量或
增加溶液P1、P2和P3的用量。对低拷贝数质粒,提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液P1、P2和P3,可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。
5. 溶液使用不当:溶液P2、P3在温度较低时可能出现浑浊,应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液,才能使用。
6. 吸附柱过载:不同产品中吸附柱吸附能力不同,如果需要提取的质粒量很大,请分
多次提取。若用富集培养基,例如TB或2×YT,菌液体积必须减少;若质粒是非
常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率,则需减少LB培养液体积。
7. 质粒未全部溶解(尤其质粒较大时) :洗脱溶解质粒时,可适当加温或延长溶解时间。
8. 乙醇残留:漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体,再加入洗脱缓冲液。
9. 洗脱液加入位置不正确:洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅
胶膜的表面达到最大洗脱效率。
10. 洗脱液不合适:DNA只在低盐溶液中才能被洗脱,如洗脱缓冲液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA,pH8.5)或水。洗脱效率还取决于pH值,最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内,如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用,有利于提高洗脱效率。
11. 洗脱体积太小:洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高,但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。
12. 洗脱时间过短:洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置1分钟可达到较好的效果。

Q: 质粒纯度不高,如何解决?
A:  
1. 混有蛋白:不要使用过多菌体。经溶液P1、P2、P3处理,离心后溶液应为澄清的,如果还混有微小蛋白悬浮物可再次离心去除后再进行下一步骤。
2. 混有RNA:RNaseA处理不彻底,请减少菌体用量或加入溶液P3之后室温放置一段时间。如果溶液P1已保存6个月以上,请在溶液P1中添加RNaseA。
3. 混有基因组DNA:加入溶液P2和P3后应温和混匀,如果剧烈振荡,可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。如果加入溶液P2后过于粘稠,无法温和混匀,请减少菌体用量。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解,培养时间不要超过16小时。
4. P3溶液加入时间过长:P3溶液加入后,放置时间不要太长,否则有可能会产生小片段DNA污染。
5. 含大量核酸酶的宿主菌:宿主菌含大量核酸酶,在质粒提取过程中降解质粒DNA,影响提取质粒DNA的完整性,最好选用不含核酸酶的大肠杆菌宿主菌,如DH5α和Top10。
6. 质粒的二聚体和多聚体形式:质粒复制过程中形成的,与宿主菌相关,电泳可检测出多条条带,单酶切处理后可变成单一条带。



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