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一种无酚/无氯仿组织研磨从热带木本植物中提...（二）

2020.2.01

三、结果

1、无苯酚/氯仿的CTAB / PVP / SDS-based RNA提取

在下面介绍的第一批实验中，我们开发并测试了一种使用40-60 mg牛油果、夏威夷果和芒果成熟叶片的冷冻叶组织提取RNA的方法。在发表的文献中，用于困难树种开发的大多数RNA提取方法，通过使用CTAB / PVP裂解缓冲液中调高盐（NaCl）浓度，可以提高RNA产量和质量。因此，我们使用该缓冲液裂解我们的样品。大多数提取方法都使用此缓冲液来提取RNA，同时联合使用苯酚/氯仿法从蛋白质中分离出核酸。但是，我们不使用苯酚和氯仿，因为它们具有毒性，同时它们不可能在96孔板中实现高通量。因此，我们决定通过加入一定量的异丙醇，并在裂解步骤后离心样品，来得到RNA沉淀（图1）。在这个阶段，蛋白质和不需要的化合物（如多糖和多酚）会溶解在上清液中，并且很容易可以除去。用乙醇洗涤沉淀后，将核酸重悬，并进行DNase处理，然后在异丙醇中进行另一轮沉淀并洗脱以回收RNA。图2中的质量控制显示RNA未被降解，并且260/280的比率高于1.79，表明提取过程中蛋白质被去除。260/230的比例在1.2至1.56之间，具体取决于物种，这表明残留了一些多糖。

为了改进方法，在60°培养步骤后将1％SDS添加到裂解缓冲液中。SDS是一种清洁剂，可帮助消化细胞膜并在此步骤中释放更多核酸。SDS还具有破坏核酸/蛋白质相互作用，并促进CTAB /核酸复合物溶解的特性，从而改善了核酸的沉淀并提高了产量。用SDS本身提取的样品获得的RNA产量比CTAB / PVP缓冲液更好。但是，260/230的比例非常低（1.07），无法防止样品氧化（图3a）。结合CTAB和SDS方法来改善产率（图2、3）。这在夏威夷果中尤为明显，其RNA产量几乎翻了一番。如通过裂解步骤后的样品颜色观察（图 3a），CTAB / PVP和SDS的组合也抑制了样品氧化和叶绿素变性，这是SDS的已知作用。CTAB和SDS之间的相互作用形成微胶束，产生可见的混浊沉淀，导致离心后在缓冲液和空气之间界面处形成半固体白色层。

因没有CTAB或样品管中有植物组织，SDS对产量的影响并未降低（图3）。这表明在该方法中，SDS对产量的影响可能是由于其从核酸中分离蛋白质的能力，而不是其组织裂解活性或其溶解CTAB /核酸复合物的性质。此外，添加SDS还可略微提高牛油果和夏威夷果的260/230比例，这表明CTAB和SDS的组合可在最终洗脱过程中稍微降低多糖含量（图3）。

2、从不同组织类型中提取RNA

然后，我们测试了该方法对于不同类型的组织是否有效。为了测试这一点，我们使用15–30 mg的四种不同夏威夷果组织（叶、茎、花、腋芽）进行了相同的步骤。质量/数量控制表明，该方法对夏威夷果的这四种组织类型均有效（图4）。还对根组织进行了测试，但结果不一致，不能认为是成功的（数据不包括在内）。从茎和休眠腋芽中提取的RNA量要少于从叶和花中提取的RNA，这可能是由于这种组织中所含的活细胞数量较少。对于所有组织，260/280均高于1.79，表明蛋白质已从样品中有效去除。260/230比值较低，这可能是由于这些组织类型中包含大量次要化合物。

3、使用96深孔板提取RNA

我们希望能开发一种可以同时提取大批量样本的方法。为了实现这一目标，我们注意到该方法的一个特点：在裂解步骤之后，该方法不需要在通风橱中进行移液，不像使用苯酚和氯仿的方法一样。因此，我们在2 ml 96深孔板上使用与样品管进行相同的步骤。与样品管结果相比，使用深孔板提取的结果令人满意，可以在图5中所示的质量控制结果看出。且使用96深孔板方法，仅需一天即可提取96个样品（不包括研磨时间），而使用96通道的移液器（PLATEMASTER，Gilson）可以使花费的时间更短。

4、实时定量PCR和RNA-Seq读取质量控制

为了证明提取方法所产生的RNA质量足够好，我们使用RNA进行实时定量PCR和RNA测序。用DORMANCY1（DRM1）和miR172在三种树种中获得的扩增（图 6）和解链曲线（附加文件1：图S1）证明，RNA可成功用于定量RT-PCR（图 6）。这些结果表明，即使在某些样品中260/230比值不是最佳的，用这种方法分离的RNA的质量也足以进行基因和miRNA定量分析。

为了进一步证明我们的RNA提取方法的适用性，我们使用该方法为牛油果、夏威夷果和芒果树中的每一种样品制备标准化的RNA-Seq库，并使用Illumina测序技术对其进行了测序。使用此方法获得的基因库质量控制数据表明，使用本文所述方法提取的RNA质量很好，完全满足RNA提取实验要求（图 7和附加文件2：图S2）。在使用Trimmomatic进行标准修整和质量控制后，使用FastQC版本0.11.5（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）进行质量评估，数据表明质量良好（图7），且具有统一的高质量碱基调用，以读取正向（图 7）和反向（附加文件2：图S2）序列的末尾。这说明大多数序列读数均为高质量，这为后续的遗传分析提供了保障。

5、序列映射检测

为了验证我们的RNA测序，我们使用HISAT v.2（默认设置）将修饰后的序列映射到已发布的转录组和基因组序列中（如表1）。我们牛油果样品中有76％和80％的读段映射到Persea americana var'drymifolia' and cv. ‘ Lisa’转录组序列集中。我们芒果样品的读段中有66％和69％映射到印度芒果（Mangifera indica L. cv. 'Shelly' and 'Zill'转录组序列集中。我们夏威夷果样品中有79％的读断映射到夏威夷果Madamadia integrifolia cv. 741 ‘Mauka’基因组序列集草案中。这种质量控制进一步支持了用我们的方法提取的RNA的质量足以进行各种转录组学研究。

6、无苯酚/氯仿的CTAB / PVP / SDS-based DNA提取

对树木进行DNA提取方法时通常遇到的问题与RNA提取方法相同。因此，我们决定测试这种RNA提取方法是否可以转换为基因组DNA提取方法。为实现此目的，我们通过用RNase代替CTAB缓冲液中的DTT来修改方法，以在裂解步骤中去除RNA。对于RNA提取，在裂解步骤结束时添加1％的SDS，并执行一次沉淀/洗涤/洗脱循环以回收纯化的DNA（图8）。我们的样品还包括来自室外种植的咖啡树和桉树的成熟叶片样品，这两个物种在DNA提取方面众所周知是有挑战性的。图9所示的是质量和数量控制结果，图示表明，所获得的提取量令人满意，并且提取的DNA没有降解。因此证明，该方法可以转化为困难的热带和亚热带物种样品的DNA提取方法。