定量蛋白质组学质谱采集技术进展（二）
同步母离子选择(Synchronous precursor selection, SPS)技术的出现彻底解决了MS3 响应弱的问题。SPS 技术利用多频切迹的选择波形电压(MultiNotch) [27] ,在线性离子阱中实现一次选择同时获得多个离子,最多可同时选择15 个(图2A)。利用这一原理,SPS 技术在MS2 中同时选择目标肽段的多个b/ y碎片进行MS3 分析,产生的报告离子相累积,使MS3 信号响应大幅提高(图2B)[24,28] 。实验结果表明,使用SPS 进行MS3 定量分析,即二级CID 碎裂,并同时选择多个碎片离子进行三级HCD 碎裂和Orbi-trap 检测,获得的MS3 谱图响应与传统MS2 谱图相当,定量成功率超过70%,与传统MS2 定量结果相当(图2C)[24,28] 。同时,多个碎片报告基团的叠加相比传统MS3 单个碎片报告基团,得到的比值更加稳定,定量重现性和准确度进一步增加(图2D)。此外,相比传统方法,MS3 定量方法只能用于Lys-C 酶解样品,SPS MS3 定量方法适用于广泛使用的Trypsin 酶解样品,能更普遍用于常规定量蛋白质组学[29] 。Weekes 等[30] 使用SPS MS3 技术定量研究了巨细胞病毒(CMV)感染纤维母细胞的过程和机理,获得超过8000 个蛋白(包括1184 个细胞表面蛋白)在8 个时间点感染过程中的精确定量变化,实现了实时动态定量分析,开创了定量时序病毒组学(Quantitative Temporal Viromics)领域的先河。
图2 SPS MS3 定量方法示意图[24,28] :(A) SPS MS3 方法质谱采集过程; (B) 传统MS2 、MS3 、SPS MS3 对报告离子的影响; (C) MS3 、SPS MS3 定量灵敏度对比; (D) 传统MS2 、SPS MS3 定量准确度对比
Fig.2 Schematic elucidation of synchronous precursor selection (SPS) MS3 method [24, 28] :(A) Acquisition workflow of SPS MS3 ; (B) Influence of classic MS2 ,MS3and SPS MS3 for reporter ion intensity; (C) Comparison of sensitivity of MS3 and SPS MS3 ; (D) Comparison of accuracy of classic MS2 and SPS MS3
对于同重同位素标签通量的限制,Dephoure 等[31] 尝试使用3 标SILAC 结合6 标TMT,同时定量18 组平行样本,取得了良好的效果。而近年来,质量亏损标记技术的运用,从根本上拓展了报告基团的标签容量。13C 和12C、15N 和14N 之间因核结合能形成质量亏损,巧妙利用13C14 N 与12C15N 之间6. 32 mDa的微小质量差,通过13C 与15N 相互替换,即可实现标签容量上限的突破(图3A)。例如,将TMT 6 标中TMT127、TMT129 报告基团上一个13 C 替换成15 N,形成TMT127L (12 C8 H16 15N1+ , 127. 1247608 Da) /TMT127H (12C713C1H1614N1+ , 127. 1310808 Da), TMT129L (12C613C2H1615N1+ , 129. 1314705 Da) /TMT129H (12C5 13C3H16 14N1+ , 129. 1377904 Da),标签容量提升至8 标[32] 。类似地,在不改变报告基团结构的情况下,TMT 10 标、TMT 18 标均得以实现,有效解决了多组平行样本的定量分析问题[33, 34] 。但是另一方面,6.32 mDa 的质量差异需要质谱在m / z 100 ~200 范围达到50000 以上的分辨率才能实现基线分辨(图3B),普通高分辨质谱难以胜任[33] 。而基于傅里叶变换原理的超高分辨Orbitrap 和FT-ICR,分辨率与m / z 成反比,能够轻松分辨m / z 100 ~200 的质量亏损标签[34] 。目前,基于质量亏损标记的TMT 10 标已经商品化,广泛应用于系统生物学和临床标志物研究等大样本量的定量蛋白质组学(图3C)。
图3质量亏损标记提升标签通量[33] :(A) 质量亏损标记原理(TMT-10); (B) 区分6 mDa 所需的质量分辨
率; (C) 质量亏损报告离子质谱示意图(TMT-10)
Fig. 3Increasing labeling capacity by mass defect isotopes [33] :(A) Principle of mass defect labeling (TMT-10);(B) Minimum resolution for discrimination of 6 mDa mass difference; (C) Mass spectrum of mass defect reporter ions(TMT-10)
近年来,以同步母离子选择SPS 和质量亏损标记为代表的新技术的发展,使得传统同重同位素标记定量面临的诸多问题正逐步获得解决,成为蛋白质组学相对定量的有力工具和发展趋势。
3目标蛋白定量进展:平行反应监测与多重累积
SRM 使用低分辨四极杆进行两级离子筛选和监测,在小分子分析中能有效区分目标化合物和基质背景,因为小分子的化学结构通常差异较大[35] 。然而在蛋白质组学中,由于肽段性质的相似性,SRM 难以完全排除复杂样本的背景离子,容易受到较大干扰,影响蛋白绝对定量的准确性和专一性[17,18] 。此外,SRM 还需要花费相当的精力进行离子对的选择和优化[36] 。质谱技术的改进也为SRM 带来改善。高分辨SRM (H-SRM)将四极杆的母离子选择窗口从传统的m / z 0. 7 缩小到m / z 0. 2, 从而有效地降低基质背景的干扰[37,38] 。然而,选择窗口缩小也同时降低了选择效率,因此该技术更多应用于小分子分析。此外,通过增加第三级质量筛选形成三级MRM (MRM3 )扫描,也有效提高了选择性[39] 。但是MRM3 面临着同样的问题,额外一级离子筛选降低了检测灵敏度,同时也增加了循环时间。
四极杆-高分辨串联质谱技术的发展和扫描速度的提升,为目标蛋白定量提供了新的途径。平行反应监测(Parallel reaction monitoring, PRM)正是相对于传统SRM 建立起来的高分辨离子监测技术[40,41] 。PRM 基于以Q-Orbitrap 为代表四极杆-高分辨质谱平台,与SRM 每次扫描一个Transition 不同,PRM 每次对一个母离子产生的所有Transition 进行全扫描,即平行监测了一个母离子对应的所有离子对。首先,PRM 使用四极杆(Q1)选择母离子,选择窗口通常m / z 臆2; 然后,母离子在碰撞池(Q2)中碎裂,形成子离子; 最后,以Orbitrap 取代Q3,对所有子离子进行高分辨/ 高质量精度(HR/ AM)的全扫描,完成PRM 采集(图4)[42] 。相比传统的SRM,PRM 的优势在于:(1) 高分辨子离子监测,质量精度达ppm 级(通常外标法<3 ppm,内标法<1 ppm),在不损失灵敏度的情况下,最大程度地排除了背景干扰; (2)二级为全扫描,无需事先确定离子对和优化碰撞能量,只需要在数据处理时选择响应最高的一个或几个子离子,即可提取母子离子对的色谱峰进行定量,线性范围可达5 ~ 6 个数量级; (3) 同时定性与定量分析,二级全扫描谱图用于定性分析,选择其中最佳的子离子提取离子对即可完成定量分析。
Peterson 等[40] 利用14 条标准肽段比较了SRM和PRM 两种扫描方式的选择性和灵敏度,结果表明在无基质的情况下,SRM 和PRM 的定量限均能达到amol 级; 而在酵母基质中,PRM 的定量限仍保持在amol 级,但SRM 的定量限只有fmol 级,上升了一个数量级(图5A),SRM 离子对受到很大的基质干扰(图5B)。Gallien 等[42] 使用SRM 和PRM 考察了35 条重标肽段的175 对离子对在尿液基质中的最低定量限,结果表明,只有19% 的离子对其SRM 定量限低于PRM 定量限。近来,PRM 逐渐应用到生命科学研究中,Tsuchiya 等[43] 对野生型和UFD4 基因(泛素融合降解通路)敲除型细胞中脯氨酸-茁-半乳糖苷酶(Ub-茁-bgal)的泛素化进行PRM 监测和定量分析,研究两种细胞中泛素链与蛋白连接位点的变化,证明了UFD4 与K29 型连接的泛素化密切相关。Tang 等[44] 利用PRM 验证了组蛋白H3 和H4 的甲基化、乙酰化、丙酰化等55 种修饰位点,并对修饰程度进行了定量分析,还发现了H3 K18 甲基化、H4 K20 乙酰化等诸多全新修饰位点。
图4选择反应监测SRM(A)与平行反应监测PRM(B)原理[40]
Fig. 4Principle of selected reaction monitoring (SRM)
and parallel reaction monitoring (PRM) [40
图5SRM/ PRM 灵敏度与选择性比较[40] :(A) 多种肽段在无基质和酵母基质中的定量限比较; (B) 酵母基质
中肽段GVSAFSTWEk 的提取离子流图比较
Fig. 5Comparison of sensitivity and selectivity of SRM/ PRM [40] : (A) Comparison of LOQs of peptides in neat and yeast matrix. (B) Comparison of extracted ion chromatograms of peptide GVSAFSTWEk in yeast matrix
