mRNA 显示蛋白的纯化和逆转录实验

实验材料 mRNA 显示蛋白翻译反应产物

试剂、试剂盒 Oligo 纤维素Oligo（dT）结合缓冲液Oligo 洗涤缓冲液Ni-NTA 琼脂糖NI-NTA 结合缓冲液Ni-NTA 洗脱缓冲液鲑精 DNABSADNA splintSuperscript Ⅱ 逆转录酶缓冲液DTT脱氧核苷三磷酸Superscript Ⅱ 逆转录酶脱氧核苷三磷酸溶液ATP-适配体筛选结合缓冲液ATP-适配体筛选洗脱缓冲液

仪器、耗材 层析柱凝胶过滤柱

实验步骤

实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」

1. 在层析柱中用去离子水反复洗涤 20 mg oligo （dT） 纤维素。重悬纤维素若干次并用正向压力迫使液体快速流出。最后，用 oligo （dT） 结合缓冲液洗涤一次。

2. 用 oligo （dT） 结合缓冲液将加有 KCl 和 MgCl2 的 1.3 ml 含 mRNA 显示蛋白的翻译反应产物稀释到 8.7 ml。然后与洗涤过的 oligo （dT） 纤维素一起在 4℃ 旋转孵育 15 min。

3. 使稀释的翻译反应混合物和 oligo （dT） 纤维素流过层析柱，oligo （dT） 纤维素留在过滤器板上，保留流出液。

4. 用 1 ml oligo （dT） 结合缓冲液洗涤 3 次。

5. 用 1 ml oligo （dT） 洗涤缓冲液洗涤 1 次。

6. 用 0.5 ml 去离子水洗脱 3 次。

7. 用 Tris-tricine SDS-PAGE 和闪烁计数法分析未稀释的翻译反应混合物、流出液以及所有的洗涤液和洗脱液。

8. 用下列算式计算翻译反应混合物中 mRNA 显示蛋白的浓度：

［mRNA 显示蛋白］＝ Y-1×C×［甲硫氨酸］×N-1

此处，Y 是经 SDS-PAGE 测定的 oligo （dT） 纤维素纯化的产量；C 是由闪烁计数测定的 oligo （dT） 洗脱组分合并后的计数值除以等份的翻译反应混合物的计数值；［甲硫氨酸］ 是指高盐孵育前翻译反应混合物中放射性与非放射性甲硫氨酸的总浓度；N 是指在单个显示蛋白中甲硫氨酸的平均数目。

Ni-NTA 纯化是基于 His6 标签，仅适用于库的序列中存在该标签的情况下。

9. 用 1 ml 去离子水洗涤 100 ul Ni-NTA 琼脂糖 3 次。

19. 将 0.5 ml oligo （dT） 洗脱液与 2×Ni-NTA 结合缓冲液混合，涡旋振荡以溶解， 加入 0.7 ul 2-巯基乙醇，4℃ 下与洗过的 Ni-NTA 琼脂糖旋转孵育 1 h。

11. 使 Ni-NTA 结合缓冲液和 Ni-NTA 琼脂糖流过层析柱，Ni-NTA 琼脂糖保留在过滤器板上，保留流出液。

12. 于层析柱上进行下列洗涤：

a. 用 500 ul Ni-NTA 洗涤缓冲液 1 洗涤两次。

b. 用 500 ul 4：1 的 Ni-NTA 洗涤缓冲液 1/Ni-NTA 洗涤缓冲液 2 洗涤一次。

c. 用 500 ul 3：2 的 Ni-NTA 洗涤缓冲液 1/Ni-NTA 洗涤缓冲液 2 洗涤一次。

d. 用 500 ul 2：3 的 Ni-NTA 洗涤缓冲液 1/Ni-NTA 洗涤缓冲液 2 洗涤一次。

e. 用 500 ul 1：4 的 Ni-NTA 洗涤缓冲液 1/Ni-NTA 洗涤缓冲液 2 洗涤一次。

f. 用 500 ul Ni-NTA 洗涤缓冲液 2 洗涤一次。

g. 用 500 ul 19 ： 1 的 Ni-NTA 洗涤缓冲液 2/Ni-NTA 洗脱缓冲液洗涤两次。

h. 4℃ 下用 250 ul Ni-NTA 洗脱缓冲液旋转洗脱 30 min， 洗脱两次。

洗脱液中应加入 EDTA 到 5 mmol/L 以结合被洗脱的 Ni2＋。

13. 用 Tris-tridne SDS-PAGE 和闪烁计数法分析起始材料、流出液以及所有的洗涤液和洗脱液。

在 Ni-NTA 结合和洗涤缓冲液中应避免使用强的螯合剂如 EDTA、EGTA 和 DTT， 因为这些试剂能与固相的 NTA 竞争结合 Ni2＋，因而能将之从琼脂糖上洗脱下来。

14. 用 10 ml 去离子水流过 NAP-5 凝胶过滤柱将洗脱缓冲液置换成水。

15. 将 100 ul 10 mg/ml 鲑精 DNA 与 10 ul 1 mg/ml BSA 加入 890 ul 去离子水中，涡旋振荡，然后使此溶液流过凝胶过滤柱。

16. 使 10 ml 去离子水流过凝胶过滤柱。

17. 使 0.5 ml 样品流过凝胶过滤柱。

18. 往柱中加入 1 ml 去离子水，从柱底收集 1 ml 洗脱液。

19. 用 Tris-tricine SDS-PAGE 和闪烁计数法分析起始材料和洗脱组分。

29. 留出一小份 mRNA 显示蛋白样品不进行逆转录以用作非 RT 对照的 PCR 扩增。

21. 于冰上配制下列逆转录反应混合物。在加入 RT 缓冲液前，先将 mRNA 显示蛋白与 DNA splint （作为 RT 引物）混合，最后加入逆转录酶：

900 ul mRNA 显示蛋白

15 ul 200 umol/L DNA splint （最终为 2umol/L）

300 ul 5× 逆转录缓冲液（最终为 1×）

150 ul 100 mmol/L DTT （最终为 10 mmol/L）

30 ul 25 mmol/L （每个）脱氧核苷三磷酸（最终为 0.5 mmol/L）

5 ul 水

10 ul 200 U/ul SuperscriptⅡ 逆转录酶（最终为 1333 U/ml）

总体积 1500 ul

逆转录反应于 42℃ 孵育 50 min。

22. 用Tris-tricine SDS-PAGE 和闪烁计数法分析起始材料和逆转录产物。

除非在筛选实验前先将 mRNA 显示模板进行逆转录，在筛选实验中使用 mRNA 显示蛋白可以获得有功能的 RNA 序列。这还会减少 mRNA 显示模板干扰所显示蛋白的结构的可能性。最初用 mRNA 显示筛选出的蛋白质可能需要在逆转录条件下进行孵育以使其形成有活性的构象。

23. 参照厂家的说明用 NAP-5 凝胶过滤柱将缓冲液置换成筛选缓冲液。

24. 使 10 ml 筛选结合缓冲液流过凝胶过滤柱。

25. 将 100 ul 10 mg/ml 鲑精 DNA 与 10 1 mg/ml BSA 加入 890 ul 筛选结合缓冲液中，涡旋振荡，然后使此溶液流过凝胶过滤柱。

26. 使 10 ml 筛选结合缓冲液流过柱子，并使 0.5 ml 样品流过凝胶过滤柱。

27. 加入 1 ml 筛选结合缓冲液到凝胶过滤柱的顶端，然后收集 1 ml 柱底流出的洗脱液。

28. 用Tris-tricine SDS-PAGE 和闪烁计数法分析起始材料和洗脱组分。

表1 mRNA 显示蛋白的翻译反应

注意事项

其他

1. 材料

1.3 ml mRNA 显示蛋白翻译反应产物

2. 试剂

Oligo（dT）纤维素（Amersham Pharmacia Biotech）

Oligo（dT）结合缓冲液

Oligo（dT）洗涤缓冲液

Ni-NTA 琼脂糖（Qiagen）

NI-NTA 结合缓冲液

2-巯基乙醇

Ni-NTA 洗涤缓冲液 1

Ni-NTA 洗涤缓冲液 2

Ni-NTA 洗脱缓冲液

10 mg/ml 鲑精 DNA （Life Technologies）

1 mg/ml BSA

200 umol/L DNA splint

5× Superscript Ⅱ 逆转录酶缓冲液（NEB）

0.1 mol/L DTT

30 ul 25 mmol/L（每个）脱氧核苷三磷酸（最终为 0.5 mmol/L）

200 U/ml Superscript Ⅱ 逆转录酶（NEB）

25 mmol/L 脱氧核苷三磷酸溶液

ATP-适配体筛选结合缓冲液

ATP-适配体筛选洗脱缓冲液

3. 耗材

层析柱（Bio-Rad）

凝胶过滤柱（如 NAP-5，Amersham Pharmacia Biotech）