Techniques:培养、鉴定、和16s测序
微生物识别和诊断的分子技术
依赖培养的方法太慢，于是可以使用一些分子信号，如核苷酸、蛋白质、代谢化合物。
16s rRNA gene PCR在诊断微生物方面广泛使用。PCR-based 方法更为敏感和定量化：
1.qPCR：对扩增进行定量。扩增时在特定的靶向探针上加上荧光染料，裂解后造成荧光信号的逐渐增加，从而定量细菌的载量，可以用于监控细菌感染的过程。
2.droplet digital PCR：模板分子被分为不同的droplets，然后扩增，根据droplets的counts数进行定量。这个可以检测出传统PCR认为的阴性和背景噪音的低丰度target。
DNA提取方法和PCR引物的选择：
DNA提取时需要考虑到PCR inhibitors，以及部分细菌物种可能导致的偏倚。
PCR引物可以选择double-ended barcoding提高数据质量。
OTU与扩增子测序变异（ASV）
OTU：聚类后比对，consenus在97%
ASV：不进行聚类，对每条序列进行error rate 判断后筛选出剩余的代表一个微生物，常用的pineline有DADA2、UNOISE3、Deblur，优势是直接用序列识别物种，没有人造的ID。
不同的物种比对数据库
NCBI、RDP、Greengenes、SILVA，这些数据库的比对结果各有不同，有研究表明SILVA的结果要稍微的好一些，这个数据库的优势在于更新较为频繁，包括新序列和改进命名法。这些数据库都不是完全准确的，会导致错误识别，比对时包括与某一特定环境相关的细菌taxa能改进taxonomic assignment。
16s测序的说明
适合用于物种分类而不适用于功能研究。由于细菌存在横向基因转移带来的质粒和基因突变，仅用部分或者全部的16s很难预测全部基因及功能。
了解临床微生物学中的微生物组
对于呼吸道疾病，如CF、支气管扩张、COPD，使用培养的方式鉴定病原微生物，耗时且容易失败，导致临床上，病人经常使用广谱抗生素“one size fit all”，可能会引起耐药性。
NGS提供了一种快速、便宜的PPM检测方法，但是检测了全部的微生物，还需要进一步确定治疗的靶点，所以16S的方法不能确定临床相关的微生物，需要培养和宏基因组的方法确定它们的功能，及宏基因组、宏转录组的方法，但是会很耗时，快速临床诊断方面不如16s，三代测序的出现加快了这一进程。
