5分钟了解活细胞成像：记录真实过程 揭示生命真相
对人类活动的记录促使了抖音等视频的流行，对科学的观察和记录也有同样的追求，正在从静态的“快照”观察转向对活体动态过程的描述。目前研究活性物质生物活性的最有效手段正是活细胞成像，它彻底革新了生物学家研究细胞、蛋白质以及众多分子之间相互作用和生理过程的方式，活细胞成像市场正在吸引着大量公司的进入，预计2025年将达到280亿美元。本文将介绍活细胞成像的市场和主要技术，并在下篇介绍近几年推出的主要产品，希望为您下次入囊前提供参考。
市场概要
活细胞成像使用延时显微镜对活细胞的深入研究，首次引入用于显示海胆卵的受精和发育。它是生物医学研究学科和实验室研究的重要分析工具，如神经生物学，发育生物学，药理学和细胞生物学。它是获得图像质量和维持健康细胞之间的折衷，在生命科学研究实验室中起着至关重要的作用，通过研究细胞行为和途径，更深入地了解疾病机制、功能和对治疗的反应，并从细胞的珍贵样本中获得最大信息。此外，生物学研究越来越关注动态过程，如细胞内运输，迁移和细胞发育。由于已经开发了几种显微镜方法来以更少的努力和更详细的方式研究活细胞，研究人员可以比任何其他方法更有效地理解活细胞的性质，比如一种更稳定的、利用量子点的新型成像。成像技术的不断进步和荧光探针的设计提高了活细胞成像的能力，并成为生物学中的重要工具。
在生物学研究中，当前对更可靠、更相关的活细胞的需求比固定细胞显微镜的需求更大；一些成像系统还能够维持活体动物体内的分子。活细胞成像在预测组织、模型生物、小动物发育和结构研究的3D成像方面的应用越来越多，这将在未来推动全球活细胞成像市场的发展。活细胞成像正在成为许多生命科学和生物医学研究领域的必要技术，如细胞生物学、发育生物学、癌症生物学和药物发现。
全球活细胞成像市场规模预计将从 2020 年的 180 亿美元增长到 2025 年达到 280 亿美元，在预测期内以 8.8% 的复合年增长率增长。
来源：marketsandmarkets网站
驱动活细胞成像市场增长的主要动力来自于：药物发现中越来越多地采用高内涵筛选技术，以及癌症发病率的上升；政府投入和研究资金的增长，细胞生物学应用范围的不断扩大；对再生医学研究的投资。然而，高内涵筛选系统具有较高成本是限制增长的因素。
主要技术
活细胞成像市场的技术部分分为延时显微镜、光漂白后的荧光恢复（FRAP）、高内涵筛选、荧光共振能量转移（FRET）、荧光原位杂交等。
活细胞成像技术用于通过管形成试验研究血管生成，在趋化性试验或伤口愈合试验中研究细胞迁移，测量细胞随时间的增殖，并使用特异性荧光染色高分辨率显微镜分析细胞间和细胞内信号传导。活细胞成像是制药行业和细胞生物学实验室的基础研究工具，可帮助定位药物靶点，研究与疾病有关的分子机制。活细胞成像技术在癌症研究中得到了广泛应用，使研究人员能够更容易地研究癌细胞与其环境之间复杂且往往鲜为人知的相互作用，并在药物开发阶段筛选新药的毒性作用。此外，该过程还可以用于监测活体动物中的分子，对生物研究人员有巨大的好处。它可以最大限度地减少免疫染色和细胞固定等其他成像技术产生的伪影，并生成其他生化方法无法获得的定性和定量数据，从而促进全球医疗市场的需求。然而，其较高的实施成本限制了其市场应用。
市场动态
推动因素：药物发现中高内涵筛选技术的引进扩大
传统的毒性和药物安全性研究方法涉及通过高通量筛选对大型文库进行筛选，这种方法价格昂贵、成功率低，并耗费大量资源和时间。为了克服这些挑战，制药公司越来越多地采用高内涵筛选（HCS）技术，基于细胞的测定来识别药物开发研究中毒性的影响（基于细胞成像可以监测药物毒性机制，如氧化应激，微核，线粒体功能障碍，脂肪变性和细胞凋亡）。HCS的使用使药物开发过程更具时间和成本效益。在预测期内推动市场增长的主要因素包括：对毒性研究的高内涵筛选，活细胞成像在HCS中用于识别来自体外、体内和离体系统等复杂系统的有意义信息。由于遗传靶向肽的增加，荧光共振能量转移技术的市场也将显著增长。
制约因素：高内涵筛选系统的高成本
高内涵筛选（HCS）仪器配备了先进的特性和功能，因此价格昂贵。学术研究实验室预算有限、很难负担；主要的买家是制药公司，由于它们需要多套HCS系统，高昂的仪器价格也是其关注的问题；而且维护成本和其他一些间接费用还增加了这些仪器的总体拥有成本。这是限制活细胞成像仪器在临床和研究应用中采用的主要因素之一，特别是在新兴国家。
机遇：新兴市场尚未开发的潜力
巴西、俄罗斯、印度和中国等新兴市场预计将为活细胞成像市场的增长提供重要的机会，这主要归因于这些国家各种研究机构的研发资金不断增加。目前，中国约占全球研发支出的20%，是仅次于美国的全球第二大研发投资国；预计到2023年，中国的研发支出将超过美国。中国市场的驱动力是：临床前活动追求节约成本和符合法规，生命科学研究的资金和投资不断增加，高技能人才的可用性，有利的监管环境，中国有许多CRO为跨国制药公司提供临床前和临床研究服务，预计未来几年中国临床前/临床研究的增长将增加中国对活细胞成像的需求。
挑战：在细胞培养物中维持细胞活力和细胞环境
成功运行活细胞成像实验可能是一个重大挑战，在显微镜下维持细胞的条件决定了实验的成功或失败，在载玻片上维持活细胞是实验中最关键的部分。实验中使用的细胞应处于良好状态，并在存在合成荧光团或荧光蛋白的显微镜下正常运作。此外，在实验过程中保持恒定的细胞环境非常重要。细胞应在二氧化碳培养箱的培养基中生长，温度在维持培养物中的细胞活力方面也起着至关重要的作用。由于细胞活力和细胞环境取决于几个特定的要求，因此活细胞成像实验失败的可能性很高。
市场细分
活细胞成像市场的应用领域分为细胞生物学、干细胞、发育生物学和药物发现。基于最终用户，活细胞成像市场分为制药和生物技术公司，学术和研究机构，合同研究组织（CRO）。制药和生物技术公司占市场最大份额，主要归因于不断增长的研发活动和各种重磅药物的ZL壁垒。
基于产品和服务，全球活细胞成像市场分为仪器，消耗品，软件和服务。仪器可分为显微镜、独立系统、细胞分析仪和配件；消耗品市场分为试剂、分析试剂盒、培养基和其他消耗品。仪器增长最快，消耗品也将显着增长。
从地理上讲，全球活细胞成像市场分为北美，欧洲，亚太地区，南美以及中东和非洲。预测期内北美占据活细胞成像市场最大份额，主要来源于政府对生命科学研究的资助增加。亚太地区具有最高的增长率，主要归因于政府对干细胞治疗研究的举措，再生医学研究的日益突出，中国临床前/临床研究的增长，印度制药业外国直接投资（FDI）法规的有利变化，韩国制药和生物制药部门的增长等因素。
该市场的主要参与者包括丹纳赫的美谷分子和徕卡（美国），卡尔蔡司（德国），尼康（日本），奥林巴斯（日本），珀金埃尔默（美国），布鲁克（美国），赛默飞世尔科技（美国），赛多利斯/ Essen（德国），牛津仪器（英国），安捷伦/BioTek仪器（美国），Etaluma（美国），CytoSMART （荷兰），NanoEnTek（韩国），Phase Focus（英国）， Tomocube（韩国）、Phase Holographic Imaging PHI AB（瑞典）、BD Biosciences（美国）、Sony Biotechnology（美国）、Merck KGaA（德国）、KEYENCE（日本）、ibidi（德国）、Bio-Rad（美国）、Logos Biosystems（韩国），Nanolive SA（瑞士），ATTO公司， Enzo Life Sciences，Petaluma。
成像技术
活细胞成像技术彻底革新了生物学家研究细胞、蛋白质以及众多分子之间相互作用和生理过程的方式。这项技术使得科学家们可以实时或者在一段时间内观察细胞内部结构和细胞生理过程。了解这些细胞结构和动态过程对于解释许多细胞生物学问题是至关重要的。相关技术可见下表。
表1 一些常见的活细胞成像实验方法及其缩写
| 实验需求 | 方法 | 名称缩写 |
| 观测分子在细胞内，以及细胞之间（通过缝隙连接）的运动 | 漂白后荧光恢复 | FRAP |
| 离子浓度（钙、镁）的时间或空间变化 | 离子成像 | - |
| 细胞内钙离子浓度的定量 | 比例法离子成像 | - |
| 生物传感 | 荧光共振能量转移 | FRET |
| 观测发生在细胞膜上或者附近的事件，或者对薄切片成像 | 全内反射显微成像 | TIRF |
| 对细胞进行长期成像 | 时域荧光寿命显微成像 | TD-FLIM |
| 观测某个分子随着时间的扩散情况 | 单分子示踪-荧光相关谱 | SMT-FSC |
| 单分子的精确分辨 | 超分辨光学成像 | - |
漂白后荧光恢复（FRAP）
活细胞成像通常被用来观测细胞内的分子运动，已有多项显微成像技术能够实现这一目标，如漂白后荧光恢复（Fluorescence Recovery After Photobleaching，FRAP）。在进行FRAP实验时，需要使用高强度的光将亚细胞区域光漂白，然后检测荧光随时间恢复的情况，根据其恢复速度可以计算出膜蛋白或膜脂质的扩散速率。荧光恢复的速率取决于荧光分子扩散或者主动运输到漂白区域的数量。下图展示了一常规的FRAP的例子。FRAP还可以用来研究分子通过缝隙连接的运动过程。漂白后荧光损失实验（Fluorescence loss in photobleaching，FLIP）和漂白后荧光恢复实验类似，但是漂白区域是被持续的漂白。
FRAP图例
荧光能量共振转移（FRET）
荧光能量共振转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer ，FRET）是较早发展起来的一门技术，随着绿色荧光蛋白应用技术的发展，FRET已经成为检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具，在生物大分子相互作用分析、细胞生理研究、免疫分析等方面有着广泛的应用。FRET是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）。
FRET原理
时差显微镜（TLM）
时差显微镜（Time-Lapse Microscopy，TLM）可以被描述为显微镜中的一种延时摄影。在这里，电影帧的捕获频率低于用于播放序列的频率，这使得当序列以正常速度播放时，时间似乎移动得更快和流逝。因此，这种技术是一种时间操纵，其中可能需要几分钟或几小时的现实生活事件在几秒钟内被观察到完成。
TLM图例
高内涵筛选（HCS）
高内涵筛选（High Content Screening，HCS）是指在保持细胞结构和功能完整性的前提下，同时检测被筛样品对细胞形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号转导各个环节的影响，在单一实验中获取大量相关信息，确定其生物活性和潜在毒性。从技术层面而言，高内涵筛选是一种应用高分辨率的荧光数码影像系统，在细胞水平上检测多个指标的多元化、功能性筛选技术，旨在获得被筛样品对细胞产生的多维立体和实时快速的生物效应信息，也使在细胞水平全面评价活性化合物的成药性成为可能，在新药研发中发挥越来越重要的作用。
HCS图例
荧光原位杂交（FISH）
荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization，FISH）是20世纪80年代末在放射性原位杂交技术基础上发展起来的一种非放射性分子生物学和细胞遗传学结合的新技术，是以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。原理是利用报告分子（如生物素、地高辛等）标记核酸探针，然后将探针与染色体或DNA纤维切片上的靶DNA杂交，若两者同源互补，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。此时可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待DNA进行定性、定量或相对定位分析。
FISH原理
离子成像
传统的宽场荧光显微镜由于光散射的影响，只能够对大脑浅层的神经元或在离体组织上进行成像，共聚焦显微镜由于光损伤较大，一般也只用于离体钙成像。随着荧光显微镜技术的迅速发展，在体钙成像技术得到了蓬勃发展。双光子荧光显微镜能够在进行活体成像的时候实现高分辨率和高信噪比。例如，用双光子显微镜对海马树突棘的钙离子信号进行成像，研究神经元突触后长时程抑制。
双光子钙成像
考虑到部分内容重叠，常规光学显微镜，以及依赖于荧光分子的荧光显微镜、全内反射显微成像（TIRF）、时域荧光寿命显微成像（TD-FLIM）、单分子示踪-荧光相关谱（SMT-FSC）、超分辨光学成像，不再赘述。
应用
活细胞成像系统，包括先进的显微镜系统，可帮助研究人员观察细胞分子水平、行为学变化，其中高内涵筛选对于蛋白功能、药物开发具有重要意义。
分子水平观察
基于荧光蛋白、探针方法，活细胞成像技术可检测微观指标大大增加，包括蛋白质、化合物、离子通道等方面。FRAP记录漂白后的荧光信号强度和信号恢复，动态观察蛋白质变化，可以应用于任何荧光标记的蛋白质，以及膜结合蛋白质、膜流动性。FRET技术在活细胞生理条件下无损伤的研究蛋白质-蛋白质间相互作用。FISH技术具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、人类产前诊断、肿瘤遗传学、白血病分型，实现了临床有效应用。
FRET观测细胞内hEAG1-Cerulean与CaM钙依赖的相互作用
细胞行为学观察
外界信号和细胞的固有特征会影响细胞的行为，使其参与形态的构建和进一步的分化。这些行为主要包括定向分裂(directed mitosis)、差别生长(differential growth)、细胞凋亡(apoptosis)、细胞迁移(migration)、区别粘附(differential adhesion)等
TLM观察细胞迁徙
来源：Fan C, . J Cell Biol. 2022,221(4):e202109168.
高内涵筛选
在保持细胞结构和功能完整性的前提下，不仅能同时检测被筛样品对细胞的形态、生长、周期、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号传导等方面的影响，而且能检测到靶点激活、蛋白相互作用等信息，能在单一实验中获取大量与基因、蛋白质及其他细胞成分相关的信息，从而实时快速地对样品进行多角度的分析。在小分子筛选中，目标是识别一组导致表型变化的小分子。据报道，许多基于基因表达、RNAi和小分子筛选的HCS应用都采用了自动图像分析，并且在制药和生物技术行业中开展了更多的研究。
高内涵筛选
正所谓“磨刀不误砍柴工”，活细胞成像检测技术的发展极大促进了生命科学领域的突破。在COVID-19爆发的最前沿，世界各地的许多研究人员都在从事导致COVID-19的病毒SARS-CoV-2的病毒研究。生物医学研究需要分析大量数据来开发疫苗。因此，主要的活细胞成像系统供应商，例如Leica Microsystems（德国）和CytoSMART Technologies（荷兰），都捐赠了活细胞成像系统来协助COVID-19研究人员。
在下篇文章中，我们将汇总近年来国内外市场主流活细胞分析产品，为科研和采购人员提供借鉴和参考。
参考资料：
https://www.databridgemarketresearch.com/reports/global-live-cell-imaging-market
https://mordorintelligence.com/industry-reports/live-cell-imaging-market
https://www.marketsandmarkets.com/Market-Reports/live-cell-imaging-market-163914483.html
