辣根过氧化物酶的制备方法
实验原理
过氧化物酶催化以下反应：
2 H2O2 →O2+2H2O
这一类酶以铁卟啉为辅基，所以属血红素蛋白质类（hemeProteins）。过氧化物酶在生物界分布极广，在细胞代谢的氧化还原过程中起重要的作用。
本实验是以辣根为原料，经过水的抽提，硫酸铵和丙酮分级分离，再经锌离子纯化，透析除盐，冷冻干燥，最后制得高纯度的辣根过氧化物酶。
辣根过氧化物酶分子量在40,000左右，是一种含亚铁血红素的蛋白质，等电点7.2；易溶于水，溶解度为5%（W/V），溶液呈棕红色，透明；也溶于0.58饱和度以下的硫酸铵溶液，而0.62饱和度以上则不溶。该酶最适pH为7.0（对愈创木酚为氢给体而言）。在室温下HRP在几周内保持稳定，加热到63℃后15分钟内稳定。
辣根过氧化物酶氧化还原电势很低，pH6.08时，E’0= -0.2070V；pH为7.71时，E’0= -0.5787V。
辣根过氧化物酶的作用机理可分以下几步：
第一步，形成绿色有活性的酶一底物复合物Ⅰ：第二步，复合物Ⅰ转变成红色有活性的复合物Ⅱ：
复合物Ⅰ+AH→复合物Ⅱ+A
第三步，复合物Ⅱ被还原，释放出酶：AH：表示还原型氢供体。
在一定程度上复合物Ⅱ可自发地分解成HRP和产物（P），亦可与过量的过氧化氢形成无活性的复合物Ⅲ。
辣根过氧化物酶的活力测定方法有多种，主要原理介绍如下：
1、Rz值，提纯工作的后几步以及纯酶溶液可用Rz值表明酶的纯度。
403nm处的吸收代表血红素辅基的吸收，275nm的吸收是蛋白质的吸收，结晶的HRP的Rz值为3.04。测定时的酶浓度为1毫克蛋白/毫升。
2、愈创木酚法：测k4[见反应式⑶]。以愈创木酚（邻甲氧基酚，guaiacol）为氢给体，其反应如下：
四邻甲氧基连酚有色产物四邻甲氧基连酚（E470nm = 26.6mM－1·cm－1）生成的速度（dx/dt）与底物过氧化氢以及氢供体愈创木酚的浓度有关。方程如下：
e—酶浓度；
α0—氢供体起始浓度；
x0为过氧化氢的起始浓度。
如果测定的条件选择成k4α0＞＞k1x0，可以测得k1：
所以：
—测定过程中底物减少的速度。
本实验是采用测定k4的方法来判断酶的纯度。
上述测定Rz值和k4值的方法虽然比较简单，但都不能测得酶的实际活力单位。测定过氧化物酶的传统方法是连苯三酚试验法，以过氧化氢为底物，在酶作用下，连苯三酚可形成红棓酚（Purpurogallin），在430nm处测定产物的形成。用红棓酚值（PZ）表示酶的活力。PZ表示在标准测定条件下1毫克酶所形成的红棓酚微克数。
仪器和试剂
仪器
离心机、干燥器、分光光度计。
试剂
⒈ 硫酸铵：工业纯和化学纯；
⒉ 丙酮。
⒊ 10mM pH7.0磷酸盐缓冲液：称取243.5毫克磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）和857毫克磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O），溶于400毫升水中。
⒋ 20mM愈创木酚溶液：取0.22毫升愈创木酚加水至100毫升。
⒌ 40mM过氧化氢溶液：取0.4毫升30%过氧化氢加水至100毫升（如测k1则用10mM过氧化氢溶液）。临用前配制。
⒍ 5%乙酸钡溶液
⒎ 奈氏试剂
⒏ 0.1 mol/L硝酸银溶液
操作步骤
（一）HRP的制备
⒈水提取：
称取 10斤用水冲刷干净的鲜辣根（辣根皮中亦含有丰富的HRP），用菜刀切成小碎块，在搅肉机中搅碎1~2次。碎渣浆用1倍体积的水在低温下搅拌提取过夜（亦可采用高速抽提法）。次日用甩干机（或离心机）甩干，收集滤液，碎渣再用1/4倍体积水浸泡提取一次，合并两次滤液，量总体积和度，0。
⒉硫酸铵分级分离：
在不断搅拌下，每升滤液中慢慢加入226克硫酸铵粉末（相当于0.40饱和度），大约在1~2小时内加完，置冷室中放置过夜。次日将上清液小心地用虹吸管移出，下面浑浊液以3000转/分离心15分钟，弃沉淀，合并上清液。再按每升上清液加258克硫酸铵粉末（0.8饱和度）随加随搅拌，当硫酸铵全部溶解后，置冷室过夜。次日，虹吸出上清液，沉淀部分在冰冻离心机中以13000转/分离心20分钟，弃去上清液，收集沉淀。将沉淀悬浮于100~150毫升蒸馏水中（加水量要使沉淀全部溶解为止），分装于透析袋内，放在流动自来水中进行透析1~2天，直到硫酸铵透析完毕为止（可用5%乙酸钡溶液或奈氏试剂进行检查）。然后改换成用蒸馏水透析，中间更换2~3次，用0.1 mol/L硝酸银溶液检查透析外液无氯离子为止。
将透析液合并，在冰冻离心机中以 4000转/分离心 15分钟；去沉淀，量上清液的体积。
⒊丙酮分级分离：
将上清液倒入烧杯并置冰盐浴中，在不断搅拌下，用细滴管沿杯壁加入1倍体积预冷至-15℃的丙酮，放置片刻，在冰冻离心机中以4，000/分离心15分钟，弃去沉淀。上清液再加入0.8体积（按原上清液体积）-15℃丙酮，（操作同上），静置后，在冰冻离心机中离心收集沉淀。将沉淀溶于少量蒸馏水中，透析除丙酮。可得Rz值近于1的酶溶液。
⒋精制：
将上步酶液适当稀释，滴加1M硫酸锌溶液，使酶液中锌离子浓度为10-3M，5000转/分离心10分钟，得上清液。再将沉淀用少量蒸馏水洗涤，离心，洗液与清液合并，分装于透析袋内，对水透析除盐，用微孔滤膜过滤，进行真空冷冻干燥（约得20毫克），产品呈米黄色纤维状松软物，HRP产品的Rz值可达3.0左右，置真空干燥器中低温保存。
（二）HRP的活力测定
⒈活力测定：测定k4值的方法操作如下：
取2个比色池（带盖，光程1厘米），按下表加入反应物
*酶液：将1毫克蛋白/毫升的酶液用磷酸盐缓冲液稀释10倍后应用。
加好反应物，摇匀，在470nm 读出OD值，为t=0 的读数。立即加0.01毫升40mM过氧化氢溶液于2个比色池中，即刻摇匀并记时，每隔30秒钟读数一次，约5分钟。并记下实验时的室温。
将所测样品的OD值减去相应时间对照的OD值，然后以OD值为纵坐标，时间为横坐标作图。得一直线，计算出平均每分钟光密度的增加值，即求出△x/△t，按公式⑻求出k4值。实际的实验值k4 = 2.2×10，k4 = 3.1×10，而k4 应当为3.3×10。该方法用于测定粗的无细胞提取液误差较大。
因为某些物质可干扰四邻甲氧基连酚的形成。
或不求k4值，而把在上述条件下，每分钟OD470增加0.001所需酶量定为1个HRP活力单位。
⒉蛋白质含量的测定：
将酶液适当稀释后，用 Folin一酚试剂法比色测定蛋白质含量。
