实验分析方法-PCR扩增产物
孔板夹心杂交法：
该法是通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特 异杂交使产物的间接地固定于微孔板上，然后，再用一生物素 等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一特异性较一次 杂交，漂洗后显色即可判断结果。该法需要两个杂交过程来检测 一个产物，因此，其特异性较一次杂交的检测法高。该法已用于HBV 的检测，其敏感度可达5个HBVDNA分子。此法的敏感性和特异性与 PCR32P探针的Southern杂交法相当。但PCR微孔板夹心杂交法操作简 便、快速、避免了同位素标记探针的危害，显色反应类似于临床常 规应用的ELISA，适于临床实验室常规应用。另一种微孔板杂交法不 是采用夹心法，而是直接将特异探针固定微孔板上，然后用生物素 标记的PCR产物杂交。微孔板杂交与膜印迹杂交相比，有如下优点： ①前者易操作；②固相微孔板漂洗时间短，节省了检测时间，因为 膜杂交过程中，反应剂要浸透膜中，漂洗时，使反应剂全部浸出需 要时间较长；③本底低，微孔板杂交不需Dehatdt液和预杂交以及封 闭过程。另外，微孔板固定的DNA不需再加热或UV照射。
微孔板杂交的基本过程包括L：DNA的固定，探针的杂交和酶联显色。DNA的固定
在一定盐浓度条件下，DNA单链的一端可固定在微孔板上。不同来源 的微孔板固定DNA时所需盐浓度不同。因此，必须用一系列的盐浓度 （0.15mol/L至3.0mol/LNaCl）来固定加热变性的核酸，然后，用固 定浓度的标记探针杂交。显色后，判断合适的固定盐浓度。固定方 法的选择必须使DNAzui大量的固定，且不影响杂交。用合适浓度的 NaCl或(NH4)2SO4可达到此目的。硫氰酸钠则无固定作用。盐浓度合 适时，DNA应为一端固定到微孔板上，而太低或太高浓度的盐可能使 DNA“平躺”固定在孔内而影响杂交。Mg2+虽有促进DNA固定的作 用，但它可激活Dnase，所以，一般不用。被固定的DNA应大于300bp， 否则影响杂交结果。每孔可固定高达200ng(624bp)的DNA。合适的盐 浓和固定量一经确定，可按下法固定DNA。
待固定DNA100℃加热5min变性并立即冷却。
与合适的固定液混合后，加入微孔板的孔内。固定液：10mmol/L磷 酸钠-10mmol/LEDTA，pH7.0，合适浓度的NaCl（与DNA变性混合后， 终浓度为zui适固定浓度）。
用胶布封好，浸于37℃水浴2h。
用PBS-0.05%Tween20漂洗3次。
立即用于杂交，或封闭于塑料袋内保存。
杂交
可采用标准的杂交系统杂交。夹心杂交时，是将变性的PCR产物与检 测探针一并加。杂交与漂洗时间均较一般膜杂交短。
显色
根据不同酶标检测分子的不同选择不同的底物、终止剂和测定波 长。
颜色互补分析法(A)
颜色互补分析法是利用三原色原理，当不同DNA 篇段（A和B）同时扩增时，用引 物5’端修饰技术将不同引物用不同颜色荧光素标记（A 篇段引物标记绿色的荧 光素，B标记红色的罗丹明）。如果仅有一条片段被扩增，扩增产物激发后，只有 一种颜色（红色或绿色）。如果两条不同大小的片段均被扩增，可通过电泳分离，紫 外激发后可观察到不同颜色的两条带。如果两条被扩增片段大小相同，电泳后可见一 条红绿互补色-黄色带。如果不用电泳法分离扩增片段，通过一定手段除未掺入引 物，亦可观察到扩增产物的颜色。此时，扩增产物无论大小，只要均被扩增，就可见 一条红绿互补的黄色条带。
该法简便、易于自动化，可用于检测基因，缺失、染色体转位和病原微生物。这种情 况下，只需判断产物的有无。另外，在检测多种基因实变、多种病原菌和HLA分型 时，可用复合PCR。此时，不同引物可用不同荧光素标记（如绿色的ROX；蓝色的COUM 等）。
PCR-ELISA法：(A)
本法避免了电泳和杂交的步骤，适于常规ELISA记数仪检测。因为5’端修饰后仍 可进行常规PCR扩增特异靶序列，因此，可以通过修饰其中一个引物的5’端使其携带 便于PCR产物固定的功能基团，而通过另一引物5’端的修饰使产物便于检测。
链霉亲和素的包被：不同厂家的聚丙乙烯微孔板的包被效果差异并不显著。亲和层析纯化的链霉亲和素（13U/mg，Sigma公司）用PBS-Tween液140mmol/LNaCl， 2.7mmol/LKCl，4.3mmol/LNa2HPO4，1.4mmol/LK2HPO4，0.05%(w/v)Tween20，Ph7.2 配成1μg/ml。向微孔板的每孔内加入100μl，封好，室温过个夜。 用PBS液漂洗。
扩增产物与包被板的结合：PCR产物1μl用50μ1PBS-Tween液稀释后加入包被孔内。室温下作用30min。 用PBS-Tween液漂洗6次，去除未掺入的荧光引物。 ELISA：向结合有PCR产物的孔内加入50μlPBS-Tween液稀释的HRP-抗FITC抗体，室温下作用 30min。用PBS-Tween漂洗6次。
将1mgTMB溶于1ml二甲基亚砜中，用50mmol/L醋酸钠-柠檬酸液（Ph4.9）稀释10倍， 向每孔内加入30%（v/v）H2O23μl，再加入80μlTMB液，使反应在室温下进行2～5min ，再加入80μl2mol/L硫酸终止反应。于ELISA计数仪上450nm测定OD值。另外，引物的修饰除用图2-3所示的生物素和FITC外，还可用DNA结合蛋白质的结合位 点和生物素修饰，将DNA结合蛋白质（GCN5或TyrR）包被在微孔板内，与PCR产物结合 后，可加入酶标亲和素进行ELISA检测。PCR-ELISA法可用于PCR产物定量分析。需注 意的是，定量分析时，PCR要在对数期内终止，并需设立已知标准对照。
PCR-OLA法(A)
研究表明、不同个体中同源DNA 偏段序列间的差异大部分是限定于单个核苷酸的位 置。已弄清的人遗传病的40个基因结构变异中，绝大部分属碱基替换，同样，作为遗 传连锁分析标记的大部分序列变异主要是位于基因组的非编码区的点突变。所以，一 般基因检测技术的一个重要要求是能很容易地检出单一核苷酸变异。寡核苷酸连接试 验（OLA）就是为此目的而设计的。它可以单独或结合PCR快速确定紧密相关的DNA序 列。
OLA是通过设计两种能与靶序列DNA精确并列杂交的寡核苷酸完成的。寡核酸杂交 后，DNA连接酶可使其正常配对的相邻碱基共价连接，而错配的相邻碱基可通过调节 连接酶和NaCl浓度防止其连接，连接产物可通过凝胶电泳观察其大小，或通过5’端 修饰技术使一个寡核苷酸5’端带有一个配基。连接后，通过固相化的亲和配基使其 固定，漂洗后，检测另一寡核苷酸3’端携带的适当标记分子。这一过程如重复进行 多个循环，则连接产物会呈线性增加，故称这循环进行的OLA为连接检测反应（LDR）。 此反应中若再加入两种与上述寡核苷酸互补的寡核苷酸互补的寡核苷酸进行循环的连 接反应，则称之为连接酶链反应。两寡核苷酸在无靶序列的情况下，在非常接近的位 置发生杂交的可能性极小，因此，OLA技术的假阳性极少。另外，连接酶所形成的键 是连接产物。该法适于简单、标准化的基因组样品处理法，或直接用表面活性剂和蛋 白酶初步处理有核细胞作为检测样品。需指出的是，这里是以放射性标记检测分子为 例的。如图2-6中的地高莘标记分子可避免放射性同位素的缺点，且敏感性相当，更 易于自动化。
寡核苷酸的设计与标记：用于OLA的寡核苷酸一般为20mer，使被检变异核苷酸位于 即将连接的两个寡核苷酸接头的5’端。即位于图2-6中第2步左侧寡核苷酸的3’端。 左侧寡核苷酸是5’标记生物素。右侧寡核苷酸5’端需磷酸化才能与左侧寡核苷酸的 3’-OH相连接。用PNK酶处理很易使其5’或3’标记可以选择其它标记物（如荧光素 等）。
OLA反应：向一软质圆底微滴定板内依次加入：3μlPCR扩增DNA产物；1μl剪切的鲑精DNA(10μg /μl);1μl0.5mol/LNaCl混匀室温作用10min。加入1μl0.5mol/LHCl，混匀。加入1μl生物素标记探针水溶液（140fmol）和1μl32P探针（1.4fmol），2μlT4连 接(约0.1WeiSS单位，用5×连接缓冲液稀释)。5X连接缓冲液：250mmol/LTris-HCl， Ph7.5;500mmol/LNaCl;500mmol/LMgCl2;25mmol./LDTT;5mmol/LATTP;500μg/μlBSA。 不同寡核苷酸与底物反应的连接所需酶液度不同，OLA试验时，一定要小心滴定zui适 酶浓度，提高连接温度（50℃）可扩加OLA的特异性。混匀，在100%湿度下于37℃作用1h。加入1μl1mol/LNaOH，混匀，室温下作用10min。加入1μl1mol/LHCl中和。加入2μl10%SDS，3μl15%（w/v）链霉亲和素包被的琼脂糖悬液，混匀后室温作用 10min。将一事先用0.5%奶粉-0.1%SDS-100μg/ml蛙精DNA煮过的Whatman4号滤膜置于点样器 上，然后，将微孔板内混合液加入点样孔内，真空抽滤点膜。再用数毫升1%SDS和 0.1mol/LNaOH分别依次抽洗膜。取下膜，用塑料保鲜包好进行放射自显影。
打点杂交
当扩增产物是多条带时，用点杂交更合适。这种方法的基本过 程是，首先将扩增的DNA固定到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，再 用放射性或非放射性标记的探针杂交。点杂交还有助于检测突变 DNA的突变类型，用于人类遗传病诊断和某些基因的分型。放射性同 位素32P标记的寡核苷酸探针检测的敏感性、特异性和方法的可靠性 均不容怀疑，对人们认识某些疾病与基因变异的关系起了很大的作 用。但是，由于同位素不稳定和放射性危害，不能常规用于临床或 法医检验。因而用非放射性物质（生物素、和地高莘等）标记的寡 核苷酸探针分析PCR产物以确定核酸序列变异则是一种简便而安全的 方法。非放射性标记物质稳定性高、使用方便、安全、检测速度 快。因此，本节仅叙述非放射性标记探针的点杂交与检测情况。
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综述
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