变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验
实验方法原理 | 本方法由于快捷、简便及具髙分离度,对纯化寡核苷酸非常有用。尽管得到率偏低(<50%),回收的量通常却大大超过了大多数分子生物学应用所需的量步骤亦可用于分离小RNA或其他单链多聚核苷酸。 |
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实验材料 | 核苷酸 |
试剂、试剂盒 | 浓氨水 TBE 丙烯酰胺 亚甲双丙烯酰胺 TEMED 尿素 过硫酸铵 TE |
仪器、耗材 | 真空旋转蒸发仪 电泳仪 |
实验步骤 |
1. 用浓氨水将合成的寡核苷睃从可控孔度玻璃拄上洗脱下来。于55℃加热5 h 以上。
表1、变性聚丙胺凝胶电泳能使相应片段达到最适分离度的丙烯酰胺浓度
8. 临加样前用移液器上下吹打TBE缓冲液数次以彻底洗涤样品孔。
10. 将凝胶板从电泳槽中取出,水平放置,撬开上层板。
13. 一个干净的解剖刀将条带直接切下或用墨水标记后切出,剥去塑料膜,将胶条转移至离心管中。
14. 每2 cm 的胶条加0.5 ml 的0.3 mol/l 乙酸钠,室温下在旋转揺床上洗脱过夜。
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注意事项 |
1. 灌胶后一旦拔去梳子,必须立即彻底清洗加样孔,否则由梳子带出的少量聚丙烯酰胺将会在孔中聚合,从而产生会使 RNA 条带变形的形状不规则的加样孔底面。 2. 最好用同批配制的电泳缓冲液配胶和电泳,因为离子强度或 pH 值的细微差异都会产生缓冲液前沿,使 RNA 的迁移发生严重变形。 3. 在电泳前最好进行预电泳,使过硫酸铵迁移出样品孔,并能将凝胶加温至最适于 RNA 电泳的温度。
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