直接原位PCR
| 实验方法原理 |
原位PCR是原位杂交细胞定位和PCR的高灵敏度相结合的技术，使得靶基因检测有了极大的改进。此技术是在细胞（爬片、甩片或涂片）或组织（石蜡、冰冻切片）上直接对靶基因片段进行扩增，通过掺入标记基团直接显色或结合原位杂交进行检测的方法。 |
|---|---|
| 实验材料 | 细胞或组织样品 |
| 试剂、试剂盒 | 福尔马林 二甲苯 PBS Tris-HCl Triton-X100 蛋白酶K PCR反应缓冲液 Tag酶 Tween-20 指甲油 无水乙醇 苏木素染色液 NP-40 NaCl MgCl2 BSA DAB 过氧化氢 盐酸酒精液 |
| 仪器、耗材 | 玻片 湿盒 滤纸 显微镜 |
| 实验步骤 |
一、组织切片和细胞样品的制备 1. 试剂与配置 10%福尔马林；二甲苯；PBS。 2. 操作方法 （1）用10%福尔马林固定组织8~15 h，石蜡包埋，切片（4 um），将切片置于新鲜的二甲苯中处理5 min，放入无水乙醇中浸泡5 min，取出，空气干燥； （2） 对于培养细胞，可直接制备爬片，也可有PBS洗细胞一次，加10%福尔马林静置过夜，用橡胶刮下细胞；用PBS洗细胞两次，2 000 rpmx3 min，用5 ml PBS重悬细胞，即可用甩片机甩片或直接吸50 ul点在载玻片上。 二、切片预处理（蛋白酶消化） 1. 试剂与配置 0.1 mol/L Tris-HCl (pH7.4) 缓冲液A：0.1 mol/L Tris-HCl (pH7.4)，0.3% Tween-20，0.5% NP-40 蛋白酶K：20-50ug/ml，溶于TE中 2. 操作方法 （1）干燥后的切片置于0.1 mol/L Tris-HCl (pH7.4)中，室温孵育5 min； （2）浸入缓冲液A中，室温孵育10 min； （3） 滴加20 ul蛋白酶K液于标本上，在湿盒中37℃孵育20 min； （4）在室温下，用0.1 mol/L Tris-HCl (pH7.4)漂洗两次，每次5m in。 三、原位扩增（以标记生物素为例） 1. 试剂与配置 PCR反应缓冲液：两种引物各100pmol，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各200umol， Bio-dUTP 50mol，1xPCR缓冲液； Tag酶：5U/ul 缓冲液B：0.01mol/L PBS，0.1% Triton-X100 指甲油（市售） 无水乙醇 2. 操作方法 （1）切片用1xPCR缓冲液平衡3次，每次5 min； （2） 用滤纸吸去切片上多余的液体，置60℃，每片加入30 ul PCR反应缓冲液，5 U Tag酶，用盖玻片封片，四周封以指甲油，防止蒸发； （3） 94℃变性5 min，按下列条件（94℃x2 min，55℃x2 min，72℃x3 min）循环20~25次后，72℃延伸5 min； （4）玻片浸入无水乙醇中10 min，以软化指甲油； （5） 用刀片撬开盖玻片并除去； （6） 用缓冲液B漂洗两次，每次3 min； （7）用无水乙醇固定5 min，并吹干。 四、检测（以ABC法为例） 1. 试剂与配置 缓冲液C：0.1 mol/L Tris-HCl (pH7.5)，0.1 mol/LNaCl，2 mmol/L MgCl2， 0.5% Triton-X100 封闭液：3%BSA（溶于缓冲液C中） 显色液：0.05%DAB，溶于0.05 mol/L Tris-HCl (pH7.4)，临用前每10 ml加30%过氧化氢50 ul。 1%盐酸酒精液 苏木素染色液 2. 操作方法 （1） 用30 ul 3%BSA滴加在玻片上，封闭1 h； （2）用缓冲液C简洗1 min，每片滴加ABC复合物20～30 ul，室温放置40 min； （3）缓冲液B室温漂洗3次，每次15 min； （4） 滴加显色液于玻片上，镜下观察控制显色时间（一般7～14 min）； （5）流水洗片，浸入苏木素液中复染30 s，1%盐酸酒精分化（提抽2次）； （6） 常规脱水、透明、封片，镜下观察。
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| 注意事项 |
尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意： 1. 戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套； 2. 使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染； 3. 避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面； 4. 操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度； 5. 最后加入反应模板，加入后盖紧反应管； 6. 操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性； 7. 尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区； 8. 重复实验，验证结果，慎下结论。
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