定量蛋白质组学质谱采集技术进展（三）
然而PRM 的分析通量不如SRM。PRM 能同时监测最多10 ~15 个母离子,而SRM 能同时监测上百个离子对,因为高分辨质谱的有效扫描速度通常只有10 ~15 Hz,远慢于SRM 的有效扫描速度。但是这一问题正逐步得到解决,多重累积(Multiplexing, MSX)技术的发展和使用有效提高了PRM 的分析通量。多重累积利用Orbitrap 前端的C 型阱(C-trap),不同质量的母离子依次被四极杆选择并储存于C-trap 中,等待Orbitrap 完成上次扫描后,C-trap 中储存的混合离子同时注入到Orbitrap 中进行扫描,实现最多10 个目标物的同时监测,分析通量最高可提升10 倍[45] 。Gallien 等[46] 将多重累积与PRM 结合建立MSX-PRM 技术,利用4 重累积和保留时间分段(1. 5 ~2. 5 min 窗口),在60 min 液相梯度下,定量监测了酵母全蛋白裂解液中770 个目标肽段,对应436 种蛋白。其中,同一保留时间下的肽段数量最高达60 个,在这种情况下,循环时间保持在2 s 以下,分析通量达到SRM 的水平。此外,通过优化分辨率、离子注入时间等参数,目标肽段分析通量还能进一步提高:在MSX 设为8 时,同时监测的肽段数量可达128 个[42,45] 。
综上所述,高分辨PRM 和MSX-PRM 技术的出现,解决了传统SRM 技术在定量蛋白质组学方面存在的诸多不足,为复杂样本中目标蛋白的验证和绝对定量提供了有效手段。
4数据非依赖性采集进展:基于Orbitrap 的多种全新DIA 技术
基于数据依赖性采集(Data dependent acquisition, DDA)的鸟枪法(Shotgun)是蛋白质组学的经典策略,也是蛋白质组学相对定量的主要技术手段。DDA 二级采集取决于一级扫描结果,易造成低丰度肽段的丢失,具有一定的随机性,扫描点数也不均匀。而SRM 等目标采集方法不能采集非目标肽段,而且分析通量有限。近年来发展的数据非依赖性采集(Data independent acquisition, DIA)结合了DDA 与SRM 的特点,将整个扫描范围等分为若干窗口,每个窗口依次选择、碎裂,采集窗口内所有母离子的全部子离子信息。DIA 无需指定目标肽段,通量无上限,扫描点数均匀,利用谱图库即可实现定性确证和定量离子筛选,同时数据可以回溯,相比传统DDA 和SRM 具有明显优势[47] 。
Venable 等[48] 使用线性离子阱(LTQ),以10 m / z 窗口步长依次选择、碎裂、采集,对15 N 标记的酵母全蛋白样品进行相对定量分析,开创了DIA 应用的先河。结果表明,通过DIA 提取的色谱峰,其信噪比、重现性和定量准确性均明显优于DDA,蛋白定量数量增加了87%。Gillet 等[49] 基于Q-TOF (Trip-leTOF),采用32 个连续的m / z 25 窗口建立SWATH 技术,并证明SWATH 的选择性与SRM 相当。SWATH 的发展使DIA 越来越多地应用于定量蛋白质组学[50 ~52] 。同时,基于Q-Orbitrap (Q Exactive)的DIA 技术,同样使用25 m / z 步长,通过更高的分辨率,使复杂样本定量的选择性进一步提高。此外,诸如MSE、AIF 等质量范围不分段的DIA 方法在蛋白定量中也有所应用,但由于这些方法不进行质量分段选择,而是将所有离子同时碎裂、检测,基质干扰较为严重,难以胜任复杂样本的定量分析[49,53] 。
然而,由于扫描速度的限制,基于高分辨质谱的DIA 通常需要以m / z 25 的大窗口步长分段,以确保获得足够的扫描点数进行定量。而m / z 25 的选择窗口仍然会引入较多的干扰离子,影响DIA 的定量分析效果(图6A)[54] 。
近来,全新DIA 技术的发展使DIA 的选择窗口不断缩小,DIA 定量选择性、灵敏度和重现性进一步提高。其中,前文提到的多重累积技术已应用到DIA 中,Egertson 等[54] 利用Q-Orbitrap 的多重累积功能发展了MSX-DIA 技术,随机将5 个m / z 4 窗口依次选择、累积,然后同时注入Orbitrap 进行扫描。MSX-DIA 总步长仍然是m / z 20,不影响扫描速度,而m / z 20 由5 段独立的窗口组成,实际选择窗口仅m / z 4(图6A)。数据利用Skyline 软件去卷积,即可将每个碎片归属到特定窗口中,实现m / z 4 窗口的选择性(图6B)。MSX-DIA 的选择性已接近DDA,最大程度减少了共流出肽段和杂质的干扰。Q-OT-qIT 三合一质谱技术的出现为提高DIA 性能带来了更多可能[55] 。利用Q-OT-qIT 中Orbitrap和线性离子阱互不干扰、平行工作的特点,使Orbitrap 专门进行一级扫描,线性离子阱专门进行二级DIA 扫描,线性离子阱扫描速度达20 Hz,比高分辨扫描更快。然后,使用一级超高分辨谱图进行母离子色谱峰的精确提取和定量,二级谱图只用于确证、不用于定量。因此,整体扫描速度明显增加,同时二级DIA 扫描又无需关注扫描点数,为进一步缩小选择窗口带来可能。WiSIM-DIA 和Full MS-DIA 正是基于这种模式建立的DIA 技术(图7)[56,57] 。WiSIM-DIA 将m / z 200 宽窗口一级选择离子监测扫描(Wide i-solation window-SIM)与m / z 12 窗口步长的二级离子阱全扫描相结合,24 万分辨率的宽窗口SIM 扫描有效提高了母离子的选择性,利用母离子精确质量提取色谱峰进行定量,相比经典DIA 的子离子定量灵敏度更高(图7A)。同时,利用二级谱图实现肽段定性确证。虽然与经典DIA 相比,WiSIM-DIA 二级为低分辨谱图,但选择窗口从m / z 25 缩小到了m / z 12,能有效减少基质背景的干扰。更进一步,Full MS-DIA 以m / z 3 步长进行二级采集,并插入若干24 万分辨率的一级全扫描保证母离子扫描点数,与WiSIM-DIA 一样,利用一级母离子定量、二级子离子定性(图7B)。值得注意的是,Full MS-DIA 将选择窗口缩小到仅m / z 3,其选择性与DDA 相当,数据可以直接作为低分辨谱图(母离子依1. 5 Da 质量精度)进行数据库检索,鉴定结果与DDA 高度吻合,首次使DIA 摆脱了依赖于谱图库的局限,初步实现了DIA与DDA 的统一[57] 。当然,DIA 数据直接进行数据库检索的算法和卡值方法也已出现,很快就会应用到DIA 中,从而使DIA 和DDA 一样可以直接搜库鉴定,彻底摆脱谱图库的限制,已有数据证明DIA 能够获得比DDA 更多的鉴定结果。
图6DIA 与MSX-DIA 原理[54] :(A) DIA 与MSX-DIA 采集原理与比较; (B) MSX-DIA 谱图通过去卷积归属获得4 m / z 窗口谱图
Fig. 6Schematic elucidation of data independent acquisition (DIA) and multiplexing-data independent acquisition (MSX-DIA)[54] : (A) Comparison of DIA and MSX-DIA; (B) Deconvolution of MSX-DIA spectra for 4 m / z selectivity
此外,最近发展的pSMART 技术,利用m / z 5 步长进行二级Orbitrap 扫描,并在扫描范围内插入若干一级超高分辨Orbitrap 扫描,在Q-Orbitrap 平台上实现了类似WiSIM-DIA 的采集技术[58] 。结果显示,无论是定性还是定量分析,pSMART 的灵敏度、选择性和重现性都要明显优于传统DIA。
