llumina高通量测序平台的应用（二）

3、可逆化学阻断技术测序

        利用边合成边测序(Sequencing by synthesis)的原理，加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP。这些核苷酸是“可逆终止子”，因为3’羟基末端带有可化学切割的部分，每个循环它只容许掺入单个碱基。去除其他多余的dNTP后，用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类。随后将这些基团化学切割，恢复3’端粘性，继续聚合第二个核苷酸。如此循环，直到每条模板序列都完全被聚合为双链。统计每轮收集到的荧光信号，就可得知每个模板DNA片段的序列。

4、 数据分析

    自动读取碱基，数据被转移到自动分析通道进行二次分析。

技术优势

★ 新颖的测序化学技术

    Genome Analyzer利用新颖的可逆荧光标记终止子，可以在DNA链延伸的过程中检测单个碱基掺入。由于四个可逆终止子dNTP在每个测序循环都存在，自然竞争减少了掺入的误差。

★ 可扩展的高通量

    Genome Analyzer系统每次配对末端运行后可以得到超过20Gb的高质量过滤数据。这个技术的可扩展性保证了更高的数据密度和输出，能用更少的经费完成更复杂的项目。

★ 需要样品量少

    Genome Analyzer系统需要的样品量低至100ng，能应用在很多样品有限的实验中，如免疫沉淀、显微切割等。

★ 简单、快速、自动化

    Genome Analyzer系统提供了最简单和简洁的工作流程。样品文库制备可以在几小时内完成，一个星期内就能获得高精确度的数据。由独立软件控制的自动生成DNA簇的过程可以在5h之内（30min手工操作）完成。自动化的流程不需要进行油包水PCR，减少了手工操作误差和污染的可能性，不需要机器人操作或洁净室。快速地实验流程使Genome Analyzer的能力增至最大，而自动化降低了项目的时间和费用。

★ 单个或配对末端支持

    Genome Analyzer系统支持单个片段或配对末端文库。文库构建过程简单，减少了样品分离和制备的时间。制备基因组DNA的单个片段或配对末端文库需要6h，手工操作只需3h。

平台优势

★ 灵活的平台

    针对不同的应用，可选择是否将不同的读取长度和对读测序技术相结合。

★ 高质量的测序数据

    在每个流动槽中对数百亿到数千亿碱基进行准确的碱基识别。

★ 应用广泛

    SNP和结构变异检测、(de novo)组装、转录组测序、甲基化检测。

★ 高效的样本制备

    高速自动化工作流程以及低样品量要求，可在不到一周的时间内生成数据。

技术应用

Ø 转录分析

l mRNA测序(RNA-Seq)

 一次mRNA测序实验即能快速生成以完整poly-A为尾的RNA完整序列信息，并分析基因表达、cSNPs、全新的转录、全新的异构体、剪接位点、等位基因特异性表达和罕见转录。

l Small RNA深度测序

 Small RNA测序能够测定来自不同有机体任意大小的小RNA序列，在一份样品中能同时分析4百万小RNA，是目前可应用的最广泛且最具深度的小RNA检测方法。Small RNA测序记录了文库群体中序列的数字频率，因此消除了本底信号。

l 数字化基因表达谱分析

 数字化基因表达谱通过高通量测序代表每个基因的21bp标签(tag)来快速、全面的检测一个物种特定组织在特定条件下的基因表达情况。因为标签测序无须测定表达基因的总长度，其总读取更少，敏感的更高，研究人员可在近乎不受限制的范围内调节覆盖的深度，完成罕见的转录识别和定量。

Ø 基因调控和控制

 Illumina ChIP-Seq整合了染色质免疫沉淀(ChIP)和海量平行DNA测序技术，可准确且低成本的识别和蛋白结合的DNA位点，ChIP-Seq技术为ChIP蛋白和修饰的研究提供了强大的技术支持。

 ChIP法利用抗体中特定的蛋白，特异富集性交联的DNA-蛋白质复合体。然后将寡核苷酸接头与特异性蛋白结合的DNA延伸拼接，从而可进行海量平行测序，按照片段大小进行选择后，使基因分析仪和Illumina测序技术对生成的ChIP DNA片段测序，与低分辨率的ChIP芯片技术不同，ChIP-Seq经一次测序就准确的进行全基因组的关联分析。

Ø 多重测序

        Illumina提供多重样本制备寡核苷酸试剂盒、多重测序引物和PhiX对照试剂盒，能在DNA片段中引入标记序列(tag)，从而实现在一个流动槽上对96种不同的样本同时进行测序。在保证低错误率和读取长度条件下，极大地提高了实验的可拓展性。尤其在研究某段区域或小基因组时，多重测序更具价值。