为什么要从化学发光检测转换到荧光检测
Western blot成像方法取决于二抗的标记物，常用的方法有基于酶促反应的化学发光法，基于荧光染料的可见荧光方法和红外荧光方法，那么我们应该如何选择呢？
最合适的Western blot实验方法取决于您期望获得哪些信息，也就是取决于您的实验目的，小编比较了现有方法的优缺点，并分享了自己的心得，希望能够帮助您选择到最佳的实验方法。
化学发光方法
化学发光western blot是相对容易且灵敏度极高的检测方法，灵敏度可以达到fg级。
适用于研究：通过电泳可轻松分离的分子量差异显著的蛋白。
> 检测单一蛋白
> 确定蛋白有无
> 检测抗体反应
> 蛋白纯度分析
> 检测低丰度蛋白
优势
劣势
灵敏度高
半定量
实验流程熟悉
酶促反应
兼容胶片和数字成像系统
一次只能检测单一信号
需要玻璃和重孵育
胶片没有过饱和提醒
荧光检测方法
荧光染料分为可见荧光染料和红外荧光染料，从而将荧光western blot检测分为可见荧光检测和红外荧光检测。目前可见荧光检测最多三个通道，可以同时检测三种不同的蛋白，近红外检测最多为两个通道，一定选择激光光源激发的哦，更接近近红外染料的最大发射波长680nm和800nm，增强二抗信号，提高检测的灵敏度。
荧光Western blot使用荧光染料标记的二抗进行检测，膜上的靶标蛋白浓度与可见荧光信号强度呈线性关系，实现真实可靠的定量分析。荧光染料发射光谱不同，因此在一张印迹膜上可实现多重检测。在无需剥离和重孵育条件下，进行上样量质控，可以分析翻译后修饰蛋白。
因此当您进行如下实验室，选择荧光检测方法，妥妥的：
> 同时检测多种蛋白
> 研究翻译后修饰蛋白
> 同一印迹膜的上样质控
> 精确定量western blot实验
优势
劣势
可进行多重检测
膜会有自发荧光
精准定量
信号持久稳定
实验方法不需改变太多
期刊杂志要求：
例如nature中“Image Integrity and Standards”中鼓励在一张印迹膜上进行内参和目的蛋白的的检测，同时使用合理的标准化方法：例如：全蛋白归一化。
化学发光属于酶促反应，动态范围窄，只能实现定性分析，一次只能检测一个信号，如要检测多个信号，需要剥离和重孵育，如使用胶片成像，还需要反复摸索曝光时间，显影定影设备和设备的维护，荧光检测可同时满足期刊杂志发表要求、一次可进行多个信号检测，反应条件一致，精准定量，特别近红外荧光检测方法，具有低背景，高信噪比，是现在western blot荧光定量的金标准。
