免疫学检验——免疫细胞的分离及其表面标志检测技术
第一节
免疫细胞的分离
一、外周血单个核细胞的分离
将2份6%聚蔗糖蒸馏水溶液与1份34%泛影葡胺生理盐水溶液混合，其比重为1.077±0.002，可作为常规的淋巴细胞分离液，即Ficoll分离液。
主要用于分离外周血中单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法，其分布由上到下依次为：稀释的血浆层、单个核细胞层、粒细胞层和红细胞层。
二、淋巴细胞的分离
纯淋巴细胞群的采集是利用单核细胞在37℃和Ca2＋存在时，能主动黏附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，从单个核细胞悬液中除去单核细胞，从而获得纯淋巴细胞群。
1.黏附贴壁法
2.吸附柱过滤法
3.磁铁吸引法
4.Percoll分离液法
三、T细胞和B细胞的分离
1.E花环沉降法
2.尼龙毛柱分离法
四、T细胞亚群的分离
1.亲和板结合分离法
2.磁性微球分离法
3.荧光激活细胞分离仪分离法
五、分离细胞的保存
1.短期保存技术
将分离的细胞用适量含10%～20%灭活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI1640或其他培养液稀释重悬。短期保存可置于4℃保存。
2.长期保存技术
液氮深低温（-196℃）环境保存细胞，加入二甲亚砜作为保护剂。
六、分离细胞的活力测定
活力测定最简便常用的为台盼蓝染色法。
这种染料不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染料通过细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝色，通过死亡细胞与活细胞的百分比可反映细胞活力。
七、不同细胞分离方法的综合评价
早期的免疫细胞分离技术主要是根据不同免疫细胞的物理属性（如比重不同）和生物学属性（如黏附力不同）进行分离，用目前的标准看，其分离的灵敏度或分辨率都不高。作为一种传统的分离手段其分离效果已被认可，如用单个核细胞进行的某些实验，一般被认为可以代表淋巴细胞，无特别需要一般并不采用分离纯化淋巴细胞的替代技术。作为富集某一类细胞的手段，传统的方法仍不失为简便和行之有效的技术，而且传统，如Percoll连续密度离心法仍可得到非常理想的细胞分离效果，但Percoll法分离流程长，手续繁多，若无特殊需要很少采用。
传统的细胞分离技术主要采用离心法，利用密度梯度原理进行分离，时间长、效果差。近期发展起来的细胞分离技术大多是基于利用细胞表面标志（抗原或受体）进行细胞分离，较早出现的技术以细胞亲和层析为代表。随后出现细胞固相包被技术，细胞淘洗技术，同时还有流式细胞仪分离技术，磁性微球分离法。这些技术的出现使细胞分离技术产生了实质性的进步。目前这类技术主要用于科研，在常规临床实验室中并未广泛应用。另外这类技术所依赖的设备和试剂价格昂贵，目前尚不能完全替代经典的细胞分离技术。
第二节
淋巴细胞标志及亚群分类
一、T细胞表面标志及其亚群
所有的T细胞均有共同的标志性抗原，一般认为是CD3。CD3＋CD4＋CD8－辅助性T细胞（Th）CD3＋CD4－CD8＋细胞毒性T细胞（Tc或CTL） CD4＋CD25＋ 调节性T细胞（Tr或Treg） CD2
表达于全部人T细胞和NK细胞表面，因其能与绵羊红细胞（SRBC）结合，又称为绵羊红细胞受体。
CD3
是一种多链的糖蛋白，表达于全部T细胞表面，是T细胞的表面标志，是TCR-CD3复合物的重要组成部分。
CD4／CD8
CD4和CD8分子分别表达于外周血不同的T细胞亚群表面，是区分T细胞亚群的重要标志。表达CD4的主要是辅助性T细胞，表达CD8的主要是细胞毒性T细胞。其他表面标志：致有丝分裂受体、病毒受体。
（一）辅助性T细胞
辅助性T细胞的典型表面标志是CD3＋CD4＋CD8－。已证明不同的辅助性T细胞株所产生的细胞因子不尽相同，因而认为体内至少存在两种辅助性T细胞（Th1，Th2）。研究表明，Th1主要分泌IL-2、IFN-γ或TNF-β等细胞因子辅助细胞免疫或参与迟发型超敏反应，本身具有明显的细胞毒作用；Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6或IL-10等细胞因子辅助体液免疫，参与速发型超敏反应，但本身不具有明显的细胞毒作用。
（二）细胞毒性T细胞
细胞毒性T细胞的典型表面标志是CD3＋CD4－CD8＋。与辅助性T细胞类似，细胞毒性T细胞也可以分泌细胞因子，而且不同的细胞株所产生的细胞因子也不尽相同，分泌细胞因子的特征与Th1和Th2十分相似，遂将细胞毒性T细胞再细分为Tc1与Tc2，Tc1与Tc2都有典型的细胞毒性效应。
（三）调节性T细胞
目前认为调节性T细胞主要包括两个亚群，一种是CD4＋CD25＋调节性T细胞；另一种为CD8＋调节性T细胞，其主要包括CD8＋CD28－调节性T细胞和CD8＋Qa-1限制性的调节性T细胞。
二、B细胞表面标志
B细胞表面的膜免疫球蛋白（SmIg）、Fc受体、补体受体、EB病毒受体和小鼠红细胞受体是B细胞的重要表面标志。膜免疫球蛋白（mIg）又称为BCR，表达于所有成熟的B细胞和大多数B细胞瘤的细胞表面，属于免疫球蛋白超家族原型，是B细胞最具特性的表面标志。
mIg的主要作用是结合特异性抗原，故又称为抗原受体。
成熟B细胞的mIg主要为mIgM和mIgD。
B细胞及其亚群的检测是研究自身免疫性疾病及疾病中免疫调节紊乱的重要指标。
三、NK细胞表面标志
人类NK细胞表面标志：CD16、CD56。
CD16分子又称为低亲和性IgG Fc受体，当IgG类抗体与靶细胞表面相应抗原表位特异性结合后，可通过其Fc段与NK细胞表面FcRⅢ结合，行使针对靶细胞的定向非特异性杀伤作用，也即NK细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）。
第三节
其他的免疫细胞
其他的免疫细胞包括髓系细胞，如单核-巨噬细胞以及中性粒细胞等，特别是抗原提呈细胞尤为重要。
抗原提呈细胞（APC）指能摄取、加工、处理抗原，并将抗原提呈给抗原特异性淋巴细胞的一类免疫细胞。
抗原提呈细胞可分为两类：
①“专职”抗原提呈细胞，包括巨噬细胞、树突状细胞和B细胞，它们均可表达MHC-Ⅱ类分子。
②“非专职”抗原提呈细胞，包括内皮细胞、上皮细胞和激活T细胞等，它们在某些因素刺激下可表达MHC-Ⅱ类分子，并具有抗原提呈功能。
所有表达MHC-Ⅰ类分子并具有提呈内源性抗原能力的细胞，广义上也属于抗原提呈细胞。
一、单核-吞噬细胞系统
单核-吞噬细胞系统（MPS）包括骨髓内的前单核细胞、外周血中的单核细胞和组织内的巨噬细胞。
单核-吞噬细胞的典型的表面标志是CD14。
二、树突状细胞
树突状细胞（DC）是一大类专职抗原提呈细胞，其主要有两种来源，即髓系和淋巴系。
DC是形态、表型和功能高度异质的细胞。
根据刺激T细胞增殖能力的不同，它们被分为成熟和不成熟的DC。
根据诱导T细胞分化为不同效应T细胞的功能，将它们分为诱导分化Th1的DC（DC1）和诱导分化Th2的DC（DC2）。
根据明显的谱系和细胞表型的不同，分为髓系DC和淋巴DC。
人成熟DC的主要特征表面标志为CD1a、CD11c和CD83。
第四节
免疫细胞表面标志的检测及应用
一、免疫细胞表面标志的检测方法
（一）抗体致敏细胞花环法
（二）免疫细胞化学法
通常以酶作为抗体标志物，采用细胞酶免疫组织化学技术完成（详见第十三章），并常采用生物素-链霉亲和素放大系统提高灵敏度。该类方法可用普通显微镜观察，凡着色的细胞即为相应CD抗原阳性的细胞，计算阳性细胞占总计数细胞的百分率进行定量分析。本法简便易行，不需特殊仪器，一般实验室均可采用。
（三）免疫荧光法
本法是将分离得到的外周血单个核细胞与相应的以荧光素标记的CD单克隆抗体作用（直接法），或与抗相应CD单克隆抗体作用后，洗去游离的抗体，再加入荧光素标记的抗小鼠IgG抗血清，经温育结合后，洗去多余的标记抗体（间接法），制片后用荧光显微镜观察结果，计算阳性细胞占总计数细胞的百分率。
（四）流式细胞分析法
目前免疫细胞的检测主要采用流式细胞术，结果客观准确，重复性好。
二、淋巴细胞表面标志检测的临床意义
淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功能的重要指标。由于淋巴细胞，特别是T淋巴细胞在执行免疫功能方面发挥多种作用，故有必要对各类淋巴细胞（淋巴细胞亚群）进行分析。这中间主要是通过表面标志识别进行计数。
在评价免疫功能时经常采用CD4／CD8比值。如CD4是HIV受体，HIV感染时CD4／CD8比值明显降低。但CD4阳性细胞包括了很多功能性细胞，如TH、Tr等，CD8阳性细胞也是如此，所以单用CD4／CD8比值反映免疫功能显然不够准确。除AIDS患者外，实际观察CD4／CD8比值与患者的免疫功能及临床症状的关系及意义有限。
对CD4＋和CD8＋T细胞的测定，有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反应的监测。CD4／CD8升高常见于自身免疫性疾病；而CD4／CD8降低常见于病毒感染、恶性肿瘤和再生障碍性贫血等。
在使用淋巴细胞计数资料时应特别注意淋巴细胞计数所采用的方法，因为不同的方法所得到的结果差别很大，特别是目前对淋巴细胞检测方面尚无高水平的质控以及质控标准，所以不同实验室的检测结果可比性差。标本处理方法不同、实验条件不同及镜检计数者不同都会对结果产生较大的影响。流式细胞仪检测最大限度地减少了上述影响，但在设定有关参数、定义细胞群等方面仍会受到检测者经验的影响。
淋巴细胞的活性在不同的情况下可以有很大的差别，而数量的差别很少有如此之大，因此，常采用淋巴细胞计数反映机体免疫状况。但淋巴细胞计数只是对有关淋巴细胞的数量进行分析，并不能完全代表淋巴细胞的功能，所以还应结合对淋巴细胞的功能检测综合判定其临床意义。
