质粒介导的超广谱β-内酰胺酶的耐药性问题及检验
近年来,耐药性的问题正日益成为全球医药界共同关注的焦点,细菌对抗生素耐药的机制包括:(1)细胞膜通透性的改变,使抗生素不能,或很少透入细菌体内到达作用靶位;(2)灭活酶或钝化酶的产生,如产生β内酰胺酶,使抗生素失效;(3)与抗生素结合靶位(亲和力)的改变,使抗生素的作用下降;(4)其他,如主动外排系统(泵出机制)等。其中由β-内酰胺酶介导的耐药性发展迅速,几乎每当一种新的β内酰胺抗生素应用于临床不久,即有新的能水解该抗生素的β内酰胺酶产生。超广谱β内酰胺酶(extended
spectrumβ-lactamases,ESBLs)的基本概念是(1)主要由克雷伯菌属和大肠埃希菌等肠杆菌科细菌产生。(2)在体外试验中,可使三代头孢菌素和氨曲南的抑菌环缩小,但并不一定在耐药范围。(3)加入克拉维酸可使其抑菌环扩大。(4)临床上对β内酰胺类药物(包括青霉素类和头孢类)耐药,但对碳青霉烯类和头霉烯类药物敏感。（5）由质粒介导,往往由普通的β内酰胺酶基因(TEM-1、TEM-2、SHV-1)突变而来。
ESBLs的发现和流行情况
最常见的由质粒介导的β内酰胺酶是TEM-1、TEM-2和SHV-1酶,这些酶仅对第一代头孢菌素有弱的水解活性。80年代中期,由于临床上广泛使用头孢类抗生素,尤其是头孢他啶和头抱曲松,导致TEM-1和SHV-1β内酰胺酶突变酶的出现。
1982年,英国报道发现一株产生TEM-lβ内酰胺酶产酸克雷伯菌,最初对庆大霉素耐药,对头孢他啶敏感。但使用头孢他啶后再次分离到该菌时,表现为对头孢他啶耐药。对该菌的TEM基因进行序列分析,发现与TEM-1相比,仅有一个氨基酸的差异(164位上Arg变为Ser),目前将此酶命名为TEM-12[1]。
1983年德国报道发现首例产生ESBLs(SHV-2)的臭鼻克雷伯菌,与SHV-1相比,仅有一个氨基酸的差异,即238位上的甘氨酸变成了丝氨酸[2]。
肺炎克雷伯菌是产生ESBLs的最常见菌,报道14%~16%肺炎克雷伯菌产ESBLs,从肠杆菌科其他菌,如产酸克雷伯菌、大肠埃希菌、奇异变形杆菌中也可分离到ESBLs[3-5]。
ESBLs的分类及其特点
根据Bush的分类方法,可将β内酰胺酶分为1~4四组,1组酶是由染色体编码的头孢菌素酶(又称C类酶,染色体I型酶),对酶抑制剂和依地酸(EDTA)均不敏感,对三代头孢菌素和头霉烯耐药(且有诱导产酶作用),但对碳青霉烯和四代头孢较为敏感;2组酶主要由质粒介导,又称A类酶,通常对酶抑制剂敏感而对EDTA不敏感,对不同的β内酰胺类抗生素有不同程度的耐药性,但对碳青霉烯敏感;3组酶(B类)又称金属酶或碳青霉烯酶,由染色体介导,能灭活青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类抗生素,甚至能灭活酶抑制剂,但对EDTA敏感;4组酶是染色体介导的耐抑制剂的青霉素酶。2组酶进一步分为a~f等亚类,其中2b能水解青霉素类和一、二代头孢菌素类,但对三代头孢和单酰胺类抗生素无影响,称为广谱β内酰胺酶。以后又发现了2be和2br,其中的2be对三代头孢和氨曲南均有不同程度的耐药,但对碳青霉烯和头霉烯没有影响,被命名为ESBLs[6]。
ESBLs的检测
临床分离到大肠埃希菌和克雷伯菌,均应检测是否产ESBLs,如确认为ESBLs菌株,不管体外药敏试验的结果如何,对所有三代头孢菌素和氨曲南均应报告耐药。
一、纸片扩散法检测ESBLs
1.筛选试验:选用头孢泊肟、头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟或头孢曲松(每片含量均为30μg)药敏纸片中的至少2种,用苗勒-欣顿(MHA)琼脂,标准纸片扩散法测试抑菌环直径,按美国临床标准化委员会(NCCLS)1997年标准进行判断。凡头孢泊肟或头孢他啶的抑菌环直径≤22mm,头孢曲松≤25mm,氨曲南或头孢噻肟≤27mm,均应高度怀疑为ESBLs菌株,应进一步作确认试验来加以确诊[7]。
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2.确认试验:用头孢他啶(每片30μg)和头孢他啶加克拉维酸(30μg和10μg);头孢噻肟(每片30μg)和头孢噻肟加克拉维酸(30μg和10μg);分别测量2种纸片单独及加克拉维酸的抑菌环直径。加克拉维酸和不加克拉维酸的抑菌环直径≥5mm可确认为ESBLs菌株。菌株:大肠埃希菌ATCC25922(头孢他啶:头孢他晓+克拉维酸≤2mm;肺炎克雷伯菌ATCC700603(头孢他啶:头孢他啶+克拉维酸≥5mm)[7]。 二、检测ESBLs最低抑菌浓度(MIC) 1.筛选试验:选用头孢泊肟、头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟或头孢曲松至少2种以上,用阳离子增强的MH肉汤(标准肉汤稀释法)稀释至1mg/L,凡被测菌在上述各管中能够生长(MIC≥2μg/ml),均应高度怀疑为ESBLs,应进一步作确认试验来加以确诊[7]。 2.确认试验:用标准肉汤稀释法测定MIC的方法,按NCCLS(1997)推荐的筛选和确认ESBLs的标准进行判断。选用头孢噻肟单独稀释(范围0.25~64mg/L)及头孢噻肟(稀释范围相同)加克拉维酸(每管4mg/L);头孢他啶单独稀释(范围0.25~128mg/L)及头孢他啶加克拉维酸(每管4mg/L),上述2种药物必须同时进行试验,结果加克拉维酸和不加克拉维酸的MIC差值如≥8倍(3个稀释度),可确认为ESBLs菌株。质控菌株:大肠埃希菌ATTC25922(头孢他啶:头孢他啶+克拉维酸<8倍);肺炎克雷伯菌ATCC700603(头孢他啶:头孢他啶+克拉维酸≥8倍)[7]。 三、用于ESBLs筛选的特殊试验 1.在MicroScan的一些药敏试剂条中包括了头孢泊肟、头孢他啶或氨曲南,且每种试剂条均有2种指示药物,当被试菌对这些指示药物的MIC≥2mg/L时,即可筛选出可疑的ESBLs菌株,符合NCCLS(1999)推荐的筛选药物组合及浓度范围,可用于ESBLs的筛选[7,8]。 2.用浓度梯度法(Etest法)的常规试条中的三代头孢菌素或氨曲南(2种以上),凡MIC≥2mg/L时,即高度怀疑为ESBLs,应进一步作确认试验来加以确诊。现有2种Etest法的ESBLs确认试条,分别是头孢噻肟及头孢噻肟加克拉维酸、头孢他啶及头孢他啶加克拉维酸。检测结果加克拉维酸和不加克拉维酸的MIC差值≥8倍（3个稀释度）,可确认为ESBLs菌株[7]。 Etest检测ESBLs的具体操作步骤是(1)在常规试验中选出对三代头孢MIC≥1mg/L的菌株(比NCCLS的标准低一个稀释度);(2)按NCCLS(1999)推荐的方法,用2种底物筛选和确认ESBLs(筛选试验:在头孢噻肟或头孢曲松中选1种,头孢他啶或氨曲南中选1种。确认试验:用头孢噻肟和头孢他啶);(3)确认该菌对头孢西丁的MIC≤8mg/L,以排除质粒AmpC酶;(4)再测定该菌对其他非β内酰胺抗生素的药敏模式,以指导抗菌治疗或收集流行病学资料。 四、其他检测方法(非NCCLS推荐的方法) 1.双纸片扩散法:药敏平板和菌液的制备方法与常规药物敏感试验相同,将菌液涂布在，MH琼脂平板上,贴上药敏纸片,1张为三代头孢菌素(头孢他啶、头孢噻肟或头孢曲松)或氨曲南,1张为含有β内酰胺酶抑制剂(克拉维酸10mg/L)的纸片,两纸片相距20~30mm(中心-中心),35℃孵育18~24小时,观察结果。如显示协同为阳性。 2.三相扩散法:该法又有直接法和间接法2种。直接三相扩散法是在纸片扩散法的基础上略加改动,首先按标准纸片扩散法进行操作,贴上药敏纸片,在离纸片3mm处打一个小孔(靠近平板中央一侧),内加200μl浓度为105~106的菌液,35℃孵育过夜,如在头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松或氨曲南周围的抑菌圈形状发生改变,试验为阳性。如果在上述抗生素周围的抑菌圈很小或没有抑菌环,应该用间接法重复。间接三相扩散法与直接法不同在于,直接法平板表面涂布的细菌和小孔内的细菌是相同菌,而间接法平板表面涂布的细菌是用已知对 上述药物均敏感的菌株如大肠埃希菌ATCC25922,小孔内为试验菌。如出现试验菌孔干扰敏感菌株形成抑菌环的现象即判断为阳性。该试验的优点在于可以同时了解细菌对抗生素的敏感情况和产ESBLs的情况,但需要有经验的人员来判断结果。 |
此外,尚可用生物化学技术检测ESBLs的等电点(等电聚焦电泳),或分析酶的底物谱及抑制物谱来分型。也可用分子生物学技术检测和分析编码ESBLs的基因或突变位点,如聚合酶链反应(PCR)-SSCP、PCR-限制性内切酶试验、PCR-点杂交、DNA探针或序列分析等。
ESBLs菌株的治疗原则
针对ESBLs的特性和耐药特点,推荐使用(1)碳青霉烯类抗生素,如伊米配能;(2)氨基糖苷类抗生素,如阿米卡星;(3)头霉烯类抗生素,如头孢西丁;(4)β内酰胺酶抑制剂。首选伊米配能,也可采用(2)+(3)或(2)+(4)的联合用药方案。
ESBLs菌株的出现给临床抗菌治疗带来了很大的困难,临床医师、抗生素研究人员和临床实验室应对其有充分的认识。掌握ESBLs的耐药特性和对策,建立适当的检测和报告方式,及时、准确地检测出ESBLs菌株和其他具有临床意义的耐药菌株及其耐药机制,对指导临床合理使用抗生素、延缓细菌耐药性的产生、控制耐药菌株的播散和流行以及研究、开发新型、稳定和高效的抗生素,均具有十分重要的意义。
