利用毛细管电泳分析生物和非生物样品中的手性氨基酸
氨基酸是基本的结构单元。在几百种可能的氨基酸构型中，陆地生物只有20种基本氨基酸。虽然非生物反应可能产生外消旋的氨基酸混合物，但手性均一性对蛋白质的折叠是必须的。通过测量样本中的氨基酸的丰度、类型和手性，以此作为生物标志物用来区分氨基酸是通过非生物还是生物过程形成。
气质联用（GC/MS）在分析极性有机分子时，需要额外的样品制备过程，使这些分子进入气相。而毛细管电泳（CE）分析技术有望在存在水和盐类的环境中分析极性有机物。 CE是基于液体的技术，可以在含水环境中进行所有样品制备。CE可以和多种检测方法耦合，如耦合到激光诱导荧光检测（LIF）来实现灵敏检测。CE-LIF用于手性氨基酸分析已经有几十年的历史。
本文描述了两种毛细管电泳方法用于分离在生物和非生物样品中丰度较高的17种氨基酸（七对映体对D / L-Ala，-Asp，-Glu，-His，-Leu，-Ser，-Val和三种非手性氨基酸Gly，Ala和GABA）。 13种中性氨基酸的分离利用γ-环糊精和牛磺胆酸钠胶束作为背景电解质。 酸性氨基酸对映体的分离只选用γ-环糊精作为背景电解质。
1荧光标签选择
多种胺反应性在于伯胺的衍生化。 荧光素探针的摩尔吸光率大和荧光量子产量高，是受欢迎的选择。 文献中[1]CE-LIF分析异硫氰酸荧光素（FITC）衍生的氨基酸，LOD为pmol级。它们是用稀释的样品在高浓度下进行衍生化。通过将荧光素上的反应性部分从异硫氰酸酯改变到琥珀酰亚胺酯，改善了与胺的反应性，形成更稳定的共轭物。最终选择羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）作为这项工作的荧光染料。
2氨基酸靶标的选择
可以区分每个可能的氨基酸及其对映体的检测方法是极其强大的，但这既不实用也不必要。大多数氨基酸具有相似的大小和电荷，不可能在一种条件下同时分析数百种氨基酸。即使能够同时分离，也没有必要。相反，我们选择在非生物和生物中丰度都较高的氨基酸样品进行分离。
在非生物和生物样品中存在很多重叠的氨基酸种类，有必要确定生物标志（分布模式），使我们能够区分通过生物学产生的和通过非生物反应产生的氨基酸。为此，我们确定了三种化学模式：（1）存在哪些氨基酸；（2）蛋白质氨基酸与甘氨酸的相对丰度；（3）对映体过量的存在。
对于第一种模式，可以简单地评估哪一种氨基酸存在于样品中。 图1维恩图中划分出生物样品（大肠杆菌34,35,41）和非生物样品（CR237,40和CM238,39陨石）中浓度最高的12种氨基酸。如果遇到高丰度的AIB和低丰度的蛋白质氨基酸，则符合非生物来源。然而，如果只是检测到如Leu的氨基酸，则不能表明其属于生物来源还是非生物来源。
第二种模式是蛋白质氨基酸相对于甘氨酸的相对丰度。非生物样品中分子量小、易于合成的氨基酸丰度更高，较大分子量的蛋白质氨基酸以相对于Gly的低丰度存在，如图1B所示。功能越高的蛋白质所需要的氨基酸更复杂。因此，在生物样品中分子量更高的氨基酸如Ala、Asp和Glu比Gly更丰富（图1B）。
第三种模式：手性分布。在生物样品中对映体比非常低（D/L 0.01-0.2对于Ala），而非生物反应产生外消旋混合物，其含有等量的D-和L-氨基酸（对于所有氨基酸D/L =1.0）。
图1 （A）在非生物和生物样品中12种最常见的氨基酸
（维恩图中突出了重叠氨基酸、蛋白氨基酸和非生物氨基酸）
（B）蛋白原性氨基酸相对于Gly的相对丰度
3分离优化
17种氨基酸靶标中的13个中性氨基酸：3种非手性氨基酸（Gly，GABA和β-Ala）和五种对映异构体对（D / L-Ala，-His，-Leu，-Ser和-Val）。因为相同电荷和相似的大小（特别是引入荧光团后），CE同时分离这些氨基酸具有挑战性。初始分离优化在有效长度为20cm毛细管上进行。对映体分离可以在CE中通过向背景电解质（BGE）中加入手性选择剂。最常见的手性选择剂是环糊精（CD）。为了增加通用性，CD可以与表面活性剂胶束配对以进行CD辅助的胶束电动色谱。当这些胶束由手性表面活性剂形成时，如胆汁盐，它们本身变成手性选择剂。β-CD和胆盐表面活性剂的组合对于对映异构体分离具有协同效应。这种双手性选择剂在20mMβ-CD和30mM的80mM硼酸盐BGE中，能够拆分19种FITC标记的手性蛋白氨基酸[2]，该条件被用作起点优化17种氨基酸靶标的分离。但是，因为通道短，氨基酸的分离情况差（图2A）。为了提高分离度，作者研究了向BGE中添加有机溶剂的效果。
有机溶剂通过两种作用方式可以提高分离度。 首先他们影响BGE的极性并影响分析物和手性选择剂相互作用的动力学参数。第二，他们改变粘度和BGE的介电常数，其改变电渗流（EOF）。EOF的减少允许更长的分离时间，增加分析物和手性选择剂之间的相互作用。加入几种有机溶剂（IPA，MeOH和ACN）到BGE，测试发现，BGE中添加ACN，氨基酸対映体的分离度最佳（图2B）。而当浓度高于5％ACN（v / v ）时，迁移时间增长，色谱峰展宽，分离度无明显改善。
为了进一步提高中性氨基酸的分离度，选用一系列修饰后和未修饰的CD进行尝试。CD作为有效的手性选择剂可将疏水性分析物掺入由葡萄糖分子环形成的空腔中。将CD的大小从7（β-CD）增加到8（γ-CD）葡萄糖单体环，包合腔的直径为从7.8增加到9.5。较大的腔可以更好容纳荧光素部分，增加了氨基酸和葡萄糖之间的第二手性相互作用，有可能区分L-氨基酸和D-氨基酸。
图2中性氨基酸的分离优化
向80mM四硼酸钠pH9.2的BGE中加入手性选择剂
（A）20mMβ-CD和30mM STC；
（B）20mMβ-CD和30mM STC和5％v / vACN；
（C）20mMγ-CD和30mM STC和5％v / v ACN；
（D）30mMγ-CD和30mM STC和5％v / v ACN。
峰：（1）D-His，（2）D-Leu，（3）D-Val，（4）L-His，（5）L-Leu，（6）D-Ser，（7）GABA，（9）D-Ala，（10）L-Ser，（11）β-Ala，（12）L-Ala，（13）Gly，
（14）D-Glu，（15）D-Asp，（16）L-Glu，（17）L-Asp； *染色副产品。
保持牛磺胆酸钠（STC）的浓度恒定，β-CD交换为γ-CD（20mM）。提高了中性氨基酸的分离度（图2C）。γ-CD浓度以5mM的浓度梯度进一步增加，从20增加至40mM。确定30mM是最佳的浓度（图2D）。选用20厘米有效长度毛细管，该方法可以将13种氨基酸中的12种（β-Ala和LAla保持共迁移）分离。进一步尝试优化，包括使用修改的CD和双CD的BGE，对该方法均未产生改进。
最后，为了得到更高的分离度，无需额外BGE优化，将毛细管的长度增加。在保持30-50cm的有效长度的同时测试场强常数（0.5kV/cm）（图3）。结果使用40cm毛细管可以实现所有13种中性氨基酸的基线分离。另外，手性氨基酸的对映体拆分范围为Rs 7.8-16.5。
如图2所示，中性手性氨基酸的分离需要在BGE中添加一定的添加剂以增加分析物迁移时间。但对酸性氨基酸如Asp和Glu产生影响。小的EOF和负迁移率导致分析物色谱峰展宽。通过从BGE中删除STC和5％ACN，迁移时间减少和同时拆分Asp和Glu对映体（D / L 対映体的分离度分别为15.9和14.9），在40cm毛细管上实现了分离（图4）。
图3毛细管长度对13个中性氨基酸分离的影响
场强：0.5kV / cm BGE：80mM四硼酸钠、30mM γ-CD、30mM STC和5％v / v ACN。峰：（1）D-His，（2）D-Leu，（3）D-Val，（4）L-His，（5）L-Leu，（6）D-Ser，（7）GABA，（8）L-Val，（9）D-Ala，（10）L-Ser，（11）β-Ala，（12）L-Ala，（13）Gly； *染色副产品。
图4酸性氨基酸对映异构体的分离
BGE：80mM四硼酸钠，
40cm有效长度毛细管，25kV分离电压，
峰：（1）D-Glu，（2）D-Asp，（3）L-Glu，（4）*染色副产品。
表1莫诺胡收集的样品中氨基酸的检测
该方法中中性氨基酸的检测限低至5nM，酸性氨基酸的检测限低至500nM。方法应用于分析从莫诺胡收集的样品，检测结果如表1所示。
本文描述了两种毛细管电泳方法用于分离在生物和非生物样品中丰度较高的17种氨基酸（七对映体对D / L-Ala，-Asp，-Glu，-His，-Leu，-Ser，-Val和三种非手性氨基酸Gly，Ala和GABA）。13种中性氨基酸以γ-环糊精和牛磺胆酸钠胶束作为背景电解质。酸性氨基酸对映体只选用γ-环糊精。方法应用于从莫诺胡收集的样品中氨基酸対映体的分析。
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