表观遗传学修饰对轴突再生调控作用的研究进展
轴突是神经冲动传递过程中结构与功能的基本单位。无论在中枢抑或是周围神经系统损伤后，诱导有效的轴突再生过程是改善神经功能的基础。现已证实，脊髓损伤后轴突能否再生不仅取决于其固有的生长能力，还取决于轴突所处的环境。神经系统损伤后，神经细胞对轴突再生相关基因的表达动员能力及细胞骨架原料的形成能力是决定轴突固有生长能力的主要内在因素。此外，损伤后病灶微环境内的抑制或促进介质对轴突再生的导向与干预作用作为轴突再生的外因，也同样扮演着不可忽视的角色。表观遗传学修饰系指在保持核苷酸序列稳定的情况下，基因表达状态发生可遗传变化的调节方式，包含非编码RNA、组蛋白共价修饰以及DNA甲基化修饰等。近年来，随着基因测序及染色质免疫共沉淀等技术的优化与发展，与轴突再生密切相关的表观修饰靶点被发现，这有望为神经系统损伤的临床治疗提供有力论据。笔者就轴突再生相关的表观调控机制进行综述，旨在为本领域研究提供参考。
表观遗传学修饰对轴突再生相关基因表达的调控作用
与神经干/祖细胞等前体阶段相比，成熟神经细胞受损后再生能力较差，这一特点在中枢神经系统中尤为明显。研究发现，对坐骨神经进行预损伤处理（Axt）不仅使轴突再生能力显著提高，而且使腰丛背根神经节内诸多转录因子表达上调，这些转录因子的编码基因序列由此被统称为再生相关基因（RAGs）。然而，当脊髓等中枢神经系统发生损伤后，神经细胞对RAGs表达的动员能力较弱，这也成为阻碍轴突再生的主要内部因素。因此，促进损伤后RAGs的表达是激活成熟轴突再生能力的关键。近年来，microRNA、组蛋白共价修饰以及DNA甲基化等表观遗传修饰对神经损伤后RAGs表达的调控作用被逐渐发现，这无疑为损伤后轴突再生研究提供了新靶点。
microRNA对轴突再生的调控 microRNA（miR）是重要的表观遗传调控机制，其通过识别并结合mRNA的3′端非翻译区（3′UTR）结构的方式调节蛋白质的转录与翻译过程。在神经系统中，miR的调控范围涵盖了神经发育、退变及损伤修复等过程，尤其当神经损伤发生后，神经细胞内miR表达出现剧烈波动。在这里，诸多miR对RAGs表达均具有调控作用。尽管在神经修复的自然病程中，miR的变化对RAGs表达及轴突再生的驱动作用较弱，但miR发挥的表观修饰作用为轴突再生的上调、下调双向干预实验提供了可靠的分子靶点。Zou等发现，RAGs分子1型Smad蛋白（Smad1）在Axt建模后出现表达上调，并使受损神经细胞从转录抑制状态转化为活化状态。神经系统中重要的酪氨酸激酶糖原合成酶激酶3β（GSK3β）通过对Smad1的Ser-210位点进行磷酸化的方式使Smad1失活。Jiang等的研究发现，在周围神经系统中，miR-26a对GSK3β/Smad1信号通路具有调节作用，当神经损伤发生后，miR-26a通过抑制GSK3β的方式使Smad1表达上调，从而促进轴突再生。
miR-132与轴突亲和力高，沿轴突大量分布。脊髓缺血性损伤发生后，miR-132表达上调。通过调控其下游靶点Rasa1，miR-132可对Ras所转导的细胞外信号进行干预，从而调控损伤后的轴突再生过程。Hu等通过寡核苷酸与siRNA对DRG内miR-210进行表达干预实验，发现，miR-210通过对其靶分子Eph受体相互作用蛋白A3（EphrinA3）进行正向调节的方式对损伤后的轴突再生及神经元凋亡进行调控。miRlet-7在神经系统内广泛分布，抑制DRG内let-7表达可使神经细胞内NGF水平升高，从而促进损伤后轴突再生。
此外，在调控轴突再生过程中，miR还能与表观修饰因子构成调节环路，接受下游分子的反馈调节作用，其中的典型示例就是miR-138/1型Sirtuin蛋白（SIRT1）表观调节反馈环。SIRT1是NAD依赖型组蛋白去乙酰化酶，miR-138通过调控SIRT1表达的方式抑制轴突再生。但在Axt后，SIRT1表达立即升高，并对神经元内miR-138发挥抑制作用，从而诱导轴突再生。可见，在轴突再生过程中，SIRT1同时扮演着miR-138/SIRT1通路的信号输入与输出分子的双重角色，并参与构成表观遗传学反馈环路，从而对轴突再生进行双向调节。
组蛋白共价修饰对轴突再生的调控 组蛋白的共价修饰作用又称组蛋白密码，它通过改变组蛋白及各种转录元件间的相互作用对特定基因的表达进行精准调控，主要包括乙酰化、甲基化等修饰类型。许多种类的组蛋白共价修饰可通过调控RAGs表达的方式调节轴突再生，这为轴突再生提供了新的调控靶点。组蛋白乙酰化水平的调节由组蛋白乙酰转移酶（HAT）及组蛋白去乙酰化酶（HDAC）共同完成。HAT将CoA中的活性乙酰基团转移给组蛋白N端赖氨酸残基，使其因正电荷增加而具有强疏水性，进而使染色质松散化，以促进转录过程。相反，HDAC则发挥转录抑制作用。
Puttagunta等发现，P300/CBP相关因子（PCAF）具有HAT活性，周围神经系统进行Axt后PCAF表达量增高，使H3K9乙酰化水平上升并在RAGs（如GAP43、Calanin等）的启动子区富集，提示PCAF介导的H3K9乙酰化修饰可能对轴突再生具有促进作用；通过外源性PCAF过表达的方式成功诱导轴突在抑制性介质中的再生过程。另有报道指出，过表达P300蛋白能促进卡压后视神经轴突再生，其机制可能与p53K373及H3K18乙酰化所介导的RAGs的表达上调有关。细胞分化成熟后，较低的组蛋白乙酰化水平有利于维持成熟细胞结构与功能的稳定性，但这通常以牺牲细胞修复能力为代价。Finelli等发现，HDACI与转录因子Smad1共同调控周围神经损伤后细胞内RAG的表达水平。此结果表明，成熟哺乳动物发生神经损伤后，神经细胞轴突有限的再生能力与组蛋白的低乙酰化水平直接相关，维持受损细胞的高乙酰化状态将有利于轴突再生。
与乙酰化修饰类似，组蛋白N端甲基化修饰也是基因表达的重要调控位点。组蛋白H3二价结构域由具有转录抑制作用的H3K27me3与激活作用的H3K4me3共同构成，二者对特定基因位点进行偶联调控。研究发现，在E15大脑皮层神经细胞中，H3K4me3在RAGs启动子区富集，这种富集现象使组蛋白H3二价结构域重塑，并促进上述RAGs的基因表达。而当神经细胞发育成熟后，上述启动子区域内的H3K4me3水平发生下调，取而代之的是H3K27me3的大量募集。可见，在成熟神经细胞内H3K27me3的高表达状态是导致神经损伤后RAGs动员受阻的重要原因。此现象也提示，调节组蛋白H3二价结构域对基因表达调控状态有望作为激活RAGs表达及轴突再生的有效手段。
DNA甲基化对轴突再生的调控 DNA甲基化修饰是指在DNA甲基转移酶（DNMTs）的催化下，DNA内胞嘧啶选择性地结合活性甲基基团并形成5-甲基胞嘧啶（5mC）的生理过程。周围神经损伤使DRG内DNMT3b表达量显著提高，提示神经损伤可能影响神经细胞的甲基化状态。
研究发现，脊髓损伤后叶酸结合蛋白的表达量上调，使神经细胞摄取叶酸能力增加；外源性叶酸的摄入不仅使病灶内DNMT3a及3b的表达量升高，而且DNA甲基化水平也随之增加，并促进损伤后轴突的再生能力。Lindner等发现，建立啮齿类动物大脑缺血模型后，脑实质内DNMT1表达量立即升高并使DNA甲基化水平升高；而对DNMT1进行敲除，不仅能促进神经细胞突触形成，而且对缺血组织内神经细胞具有保护作用。尽管同为DNMT家族，但DNMT3与DNMT1却发挥着截然不同的生物学作用。从功能上看，DNMT3是DNA从头甲基化作用的关键酶，它使原本未发生甲基化的DNA区域被写入甲基化修饰，而DNMT1的作用则是维持DNA甲基化水平。二者在轴突再生过程中调控靶基因的差异可能是造成上述结果的原因，即DNMT1的失活可能对RAGs的表达具有促进作用。甲基化GpC结合蛋白（MeCP2）能与DNA的CpG岛特异性结合，为DNA进行甲基化修饰提供“舞台”。研究发现，MeCP2突变后调控轴突连接及导向的Sema3F/Nnp2信号通路传递受阻，导致神经元的结构和功能异常，表现为神经元体积减小、轴突的萌发及生长障碍。
DNA去甲基化酶是擦除DNA甲基化标记的重要手段，它与DNMTs共同维持DNA甲基化水平的动态稳定。转位蛋白3（TET3）具有双加氧酶活性，能对DNA中5mC进行逐级氧化，使DNA甲基化水平降低。研究发现，在视神经发育，尤其是轴突生长的过程中，TET3氧化产物5hmC的表达量持续升高，提示DNA的去甲基化状态利于轴突形成。此外，Axt神经元内TET3表达升高，进而使核内DNA甲基化水平降低，诱导RAGs的表达并促进轴突再生。生长抑制和DNA损伤诱导蛋白45（GADD45）具有DNA去甲基化活性，是诱导DNA损伤后修复的重要蛋白。研究表明，GADD45表达量在周围神经系统损伤后立即升高，而且神经细胞内，GADD45分布区域与c-Jun等RAGs发生重叠。这提示GADD45介导的去甲基化作用可能对RAGs的表达具有调节作用。
表观遗传学修饰对轴突再生微环境的调控作用
轴突再生过程对其所处的微环境极为敏感。以脊髓损伤（SCI）为例，SCI继发性损伤使大量神经胶质细胞发生活化，这不仅引发病灶内神经抑制性介质（如Nogo、Omgp及MAG等髓磷脂抑制物）的大量释放，而且导致了胶质瘢痕的堆积，最后在脊髓内形成轴突再生难以逾越的理化屏障。近年来，组蛋白修饰及miR等表观调控机制对脊髓损伤后微环境发挥的调节作用被逐渐发现。
Shin等发现，抑制HDAC6可抵消CSPG与MAG所具有的轴突抑制作用，从而促进轴突在抑制环境中的再生过程。相反，在多聚赖氨酸等正常介质中，HDAC6失活对轴突生长却无明显作用。提示HDAC6对损伤后轴突再生具有调控作用，而对轴突生长则无明显作用。研究发现，HDACI选择性抑制剂丙戊酸（VA）不仅能促进SCI后胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）和脑源性神经营养因子（BDNF）表达，而且可以中和髓磷脂抑制因子Nogo-A对轴突再生的抑制作用。miR-133b水平在SCI后的数小时内迅速攀升，并对RhoA表达具有抑制作用，作为髓磷脂抑制信号入胞的效应分子，RhoA的失活导致胞内PI3K/AKT及MEK/ERK通路的传导受阻，从而促进轴突的再生过程。
SCI后髓内的胶质瘢痕在神经损伤后的病理修复过程中扮演着双重角色，一方面，瘢痕的产生对脊髓炎症反应具有局限作用，并借此保护脊髓组织的完整性；而另一方面，胶质瘢痕的过度分泌则对轴突再生产生隔离效应，阻碍轴突直接通过病损区域形成神经传导回路。星形胶质细胞（AS）是SCI继发损伤后胶质瘢痕的主要来源，SCI后脊髓内AS发生增殖的同时，病灶内miR-145的表达量出现下降；而对AS进行miR-145过表达则可使SCI后AS迁移活化过程受阻，并影响胶质瘢痕的分泌功能。引外，Su等发现，SCI后病灶内AS具备重新编程的能力，通过Sox2转染可使AS被转化为双皮质素（DCX）阳性的神经母细胞，而且这些DCX阳性细胞在VA的体外诱导下出现NeuN阳性及轴突等成熟神经细胞的表型。因此，与彻底抑制SCI继发损伤及AS活化相比，通过表观遗传修饰介导的转录后调节精准调控AS的分泌功能更有利于重塑脊髓功能。
展望
神经损伤发生后，促进轴突再生是重塑神经功能的基础。尽管近年来针对轴突再生机制进行了大量研究，但诱导有效轴突再生仍难以实现。现已证实，无论是轴突自身再生能力动员方面，还是改善伤后微环境方面，表观遗传修饰均发挥着重要的调控作用，这些研究结果为神经损伤的临床研究提供了可靠的理论依据。随着化学合成及药载技术的发展，目前已有多种以表观调控机制为基础的脂质体或反义核苷酸类药物启动了临床试验工作，例如，Santaris公司基于miR-122的反义核苷酸链研发的抗HVC药SPC3649以及Quark和Pfizer联合研制的以新生血管形成受体RTP801为靶点的反义核苷酸PF-655等，这些药物的安全性、机体耐受性以及治疗效果等已在前期临床试验中被充分证实。这无疑预示着miR等表观修饰靶点在轴突再生方面也同样拥有着广阔的应用前景。
