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胶体金法和化学发光免疫法联合检测血清β―HCG、假阳性分析

2018.8.15

　　人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）是受精卵着床后由胎盘合体滋养层细胞分泌的一种糖蛋白激素，分子量为3868.8u，结构中包括β链和α链2条非共价结合的亚基。α链亚基与黄体生成素（LH）、促卵泡成熟激素（FSH）、促甲状腺成熟激素（TSH）的α链亚基相类似，能与这些激素产生交叉免疫反应[1]。β链亚基与这些激素则有较大差异，交叉免疫反应很小，为免疫学检测HCG的靶位[2]。可比较精确的反映β-HCG在血中的浓度。β-HCG检测可以诊断早孕，滋养层细胞肿瘤的诊断、疗效观察和预后判断，诊断宫外孕，先兆流产的处理依据，不全流产的鉴别诊断，诊断异位HCG肿瘤，生育研究等。因此准确及时的报告β-HCG结果对临床判断一些急诊病例非常必要。由于贝克曼库尔特全自动化学发光仪在检测结果<1000mIU/mL 时用原倍（仪器编码设置为151）检测，>1000mIU/mL时必须要用稀释方法（仪器编码设置为152）检测。如冒然用编码151检测，势必造成检测重复，浪费人力物力，延迟了出报告的时间，严重时会耽误病人病情的分析。本文就本院1000例门诊妇产科病人血清分析，联合应用两种方法，节约成本，提高效率，并对3例血清胶体金初筛弱阳性发光仪阴性的血清标本做出总结讨论。
　　1.原理
　　胶体金试纸条由抗-β人绒毛膜促性腺激素（HCG）单克隆抗体和抗鼠IgG多克隆抗体分别固相于硝酸纤维膜和胶体金标记的抗-α人绒毛膜促性腺激素（HCG）单克隆抗体（固相）制成。化学发光免疫法检测原理是根据微粒子酶促化学发光，将抗体结合在特定纳米材料上，采用双抗体夹心法，以金刚烷AMPPD为标记底物，在碱性磷酸酶（ALP）的催化下，AMPPD分解成AMP-D，释放出的化学能转化为光信号而发光，发光信号的强度与ALP成正比，检测信号的强度即可达到定量分析的目的。
　　2. 材料与方法
　　2.1 标本本院1000例门诊妇产科病人血清，无溶血、黄疸等现象。
　　2.2 仪器与试剂贝克曼库尔特公司生产DXI 800化学发光免疫分析仪，试剂盒与校准品皆为美国原装进口试剂，质控品为英国朗道实验室有限公司生产的免疫多项检测用质控品。胶体金试纸条为蓝十字生物药业（北京）有限公司生产的蓝梦孕知早早孕检测试纸条。试剂、校准品和质控品均在有效期内。
　　2.3 方法
　　2.3.1用分离胶试管采取病人血液3ml，待血液凝固后用3000r/min离心10min分离出病人血清待用。
　　2.3.2室温下将胶体金试纸条有箭头的一端插入血清中，5秒钟后取出平放，5分钟内观察显示结果。测试纸插入血清深度不可超过MAX标志线，阳性对照线必须明显。在检测线位置（T）以及对照线位置（C）各出现一条红色反应线，提示阳性，仅在对照线位置（C）出现一条红色反应线提示为阴性。
　　2.3.3如果胶体金初筛结果为阴性和弱阳性，用贝克曼库尔特全自动化学发光仪上的编码151检测，强阳性就用编码152检测。
　　3.结果
　　对本院1000例门诊妇产科病人血清用两种方法检测，其中阳性结果标本560例，阴性结果标本440例，有3例胶体金检测假弱阳性结果，后用化学发光仪检测为阴性。三例病人经询问未用任何药物。两种方法结果如表1：
　　表1
　　阳性
　　阴性
　　合计
　　化学发光法
　　560
　　440
　　1000
　　蓝梦早早孕试纸条
　　 563
　　 437
　　 1000
　　4 . 讨论
　　化学发光免疫法是一种具有高灵敏度、高精密度和高特异性的免疫法[3]，贝克曼库尔特公司生产的DXI 800因此具有高特异性、高灵敏性、高准确性、高稳定性、检测速度快等特点，可以用来诊断早孕，滋养层细胞肿瘤的诊断、疗效观察和预后判断，诊断宫外孕，先兆流产的处理依据，不全流产的鉴别诊断，诊断异位HCG肿瘤，生育研究等，适应了临床诊断的要求。但是，化学发光免疫法线性范围稍窄[4]，浓度高于1000 mIU/mL时需要用仪器中预设置的稀释代码152测量，而原装试剂昂贵，成本高，重复测量既浪费了财力，也拖延了患者取报告的时间，在异位妊娠等需要术前快速明确诊断的病例中不能及时提供给临床可靠数据，延误了诊断的时间，导致临床医生难以做出正确的决策。胶体金免疫结合试验是在酶免疫结合试验的基础上的一种固相标记免疫分析技术，其特点是单份测定、操作简单（一步操作）、快速、准确性高和重复性好，除商品试剂外不需要任何仪器设备，几分钟即可用肉眼观察结果[5]。实验重复性好，特异性高，不受溶血和脂血的干扰[6]。因此联合应用胶体金方法筛选阴性和弱阳性标本，上机用化学免疫法测原倍（仪器编码设置为151）检测，强阳性结果的标本（预估>1000mIU/mL）用稀释方法（仪器编码设置为152）检测，可以克服这些缺点，节约成本，及时快速地提供给临床医生可靠数据。　　HCG是由滋养层细胞分泌的一种糖蛋白激素，由α和β亚单位组成，α亚单位的氨基酸排列顺序和黄体生成素（LH）、促卵泡成熟激素（FSH）、促甲状腺成熟激素（TSH）的α亚单位大体相同，相互间可发生交叉反应。而β亚单位结构特异，不存在于其他糖蛋白激素中，根据这一特点制备的β-HCG单克隆抗体，可将上述激素之间的交叉反应降低到最低值[7]。在用胶体金检测的440例阴性标本中，发现的3例假弱阳性标本，经化学发光免疫法检测为阴性，询问病人之前未用任何药物。该现象是因为交叉反应或因为某些原因检测到其他无活性的HCG分子造成假阳性导致。化学发光免疫法的试剂为β-HCG单克隆抗体，且准确性比胶体金高，因此，对化学免疫法检测阴性而胶体金检测弱阳性的结果应考虑上述原因。胶体金早早孕试验筛选出现的弱阳性，原因可能和试条内包埋的小鼠单克隆和多克隆抗体有关，检测可能受到非HCG分子的影响，如LH、FSH、TSH;也可能因为某些原因检测到其他无活性的HCG分子（如游离β亚单位和β-核心片段）时，血HCG值呈弱阳性[8]。因此如发现血清胶体金检测阳性与机器检测阴性不符的情况时，应考虑这些原因，育龄妇女在非排卵期可以用尿液胶体金复查排除。
　　还有一些文章报导高浓度HCG在用胶体金检测时候出现假阴性或弱阳性，也要在工作当中注意。用胶体金试纸检测尿HCG时，发现绒癌、恶性葡萄胎患者的标本出现假阴性。过量HCG分别与试纸中胶体金标记的鼠抗人HCG单克隆抗体和羊抗人HCG多抗血清结合而不再形成金标记的HCG抗体-HCG-羊抗人HCG多抗“夹心复合物”，不再出现阳性结果，此现象称HOOK现象，即钩状效应[9]。这表明，当HCG浓度远远大于胶体金试纸条的检测上限时，表现出钩状效应[10]，为HCG浓度过高导致抗原过剩造成的假象。因此如果出现胶体金检测为阴性或弱阳性，机器检测数值很高时，可以将血清稀释再用胶体金试纸条复查，如稀释后为强阳性可以判断为钩状效应所致。