合适的小鼠胚胎干细胞胞质分裂阻断微核试验CBMn分析
实验概要
观察表明，加入细胞松弛素-B到小鼠胚胎干细胞（mESC）的培养诱导细胞凋亡作CBMn分析。另一方面，加入 cyt-B是（CBMn）技术的最关键的部分。因此，改变传统CBMn分析方法是必要的。在本实验中，我们试图解决这个问题。研究表明，CBMn可作为一个可靠的工具用于胚胎干细胞研究，特别是在监测细胞遗传学的完整性。对观察mESCs诱导凋亡的潜在原因进行了讨论。
主要试剂
2-巯基乙醇(Sigma；M-7522)
原液的浓度为14.3 M(纯液体)，准备β -巯基乙醇溶液的工作液，加入70μl 2-巯基乙醇原液(14.3M)溶于10 ml PBS ，过滤消毒和储存在阴凉的地方。
Bisbenzimide H 33258，(Calbiochem，382061，100 mg)
杜尔贝科的磷酸盐缓冲生理盐水无 Mg2和Ca2 (D - PBS)(Sigma；D5652)。不要加热，立即过滤消毒。
二甲基亚砜(Sigma，Hybrimax，无菌过滤；D2650)
EGTA粉(Sigma，E-4378)EDTAD对镁具有高亲和力，对钙具有较低亲和力，而EGTA具对钙具有高亲和力，对镁具有较低亲和力。EGTA工作浓度为2mM。
胚胎干细胞适合的胎牛血清(ES FCS)，(Gibco；16141-079)FCS可能包含可以促进胚胎干细胞分化的不确定因素，因此每批产品必须事先筛选。
小牛血清(FBS)，(Invitrogen，10270-106)在-20ºC 保存，用前37ºC水浴解冻。解冻后，胎牛血清可保存于4ºC，3-4周。
注意：避免反复冻融胎牛血清。
明胶(Sigma；G2500)
L-谷氨酰胺溶液(Gibco；25030-024)
白血病抑制因子(LIF)(ESGROTM；13275)此因子通常被用来协助维持mESCs的多能性。
丝裂霉素C粉(Sigma；M0503)请注意，在培养基中的MIT-C(38℃)中含有抗生素和血清，随着时间的推移而降解。
非必需氨基酸(Gibco；11140-035)。
胸苷粉(Sigma；T1895)
胰蛋白酶EDTA(1X)的HBSS无Mg2 和Ca2 (GIBCO 25300-054)，(pH值7.8-8.7)
实验步骤
试剂配置：
1. BD基底膜™(BD Biosciences；cat. #354277)
由于基底膜™矩阵超过10℃形成凝胶，应保持在一个较低的温度。因此，所有的设备和试剂使用前应被冷藏冰上。基底膜™准备，从原液中添加350μL到6 ml 预冷媒介。4℃解冻基底膜™。
2. 细胞松弛素B(Cyt-B)(Sigma；C6762)
将5毫克的固体细胞松弛素-B溶于1毫升的二甲基亚砜。按以下方法配置浓度5000Cµg/ml的Cyt-B (1000倍溶液)：
1) 从-20℃取出置于室温下，不要取下密封盖。
2) 用70％乙醇消毒橡胶密封件的顶部，让乙醇蒸发。
3) 用2.5毫升无菌注射器，通过密封盖注射1毫升DMSO。
4) 轻轻摇晃混合物。细胞松弛素-B的容易溶解在二甲基亚砜。
5) 混合，混悬1000倍50μL的原液，分装到0.5毫升无菌聚苯乙烯管。标注日期和 “CYT-B”
6) 储存在-20ºC，12个月，小瓶粉末保证2年。
7) 分别加450μL和4950μL的DMEM培养液，制备100倍和10倍的Cyt-B 。
注意：细胞松弛素-B的是有毒的，它可能是致畸剂。
3. DMEM培养基：饲养层的生长需要。
1) DMEM培养基(Gibco；12800 -116)13.5 g/ L
2) 碳酸氢钠(Sigma；S-5761)3.7 g/ L
3) 青霉素/链霉素(Gibco；15070-063)10 ml/L
4) 盐酸(1 N)的3 ml/L
5) 2 -巯基乙醇(Sigma，M-7522)7 µL
将以上成分加入烧瓶中，搅拌加入1N NaOH或1N盐酸调整比预期的工作pH值(7.0-7.4)低0.2-0.3单位。碳酸氢盐缓冲溶液的pH值通常在过滤时提高0.1-0.2单位。
4. 胚胎干细胞培养液
1) Knock-out™ DMEM培养基(Gibco；10829-018)500毫升
2) 青霉素/链霉素(Gibco；15070-063)5毫升
3) 非必需氨基酸(Gibco；11140-035)5毫升
4) 2 -巯基乙醇(Sigma，M-7522)0.5毫升
5) ES-FCS(Gibco；16141-079)75毫升
分装避光保存于于4ºC。50毫升KO-DMEM，500μLL-谷氨酰胺和50μL LIF是需要的
5. 明胶处理瓶
1) 添加3-4毫升0.1％的无菌明胶覆盖于T-25细胞瓶的底部。
2) 37℃静置1小时。
3) 从涂层表面移除多余的液体，让干燥的空气流通约1/2小时(或者可以允许风干过夜)。
4) 在加入细胞前细胞瓶用用无菌组织培养液或平衡盐溶液冲洗。
6. 丝裂霉素C处理小鼠胚胎成纤维细胞(mEF)
1) 在14天mEF融合后加入培养液。
2) 加入200μLMit-C至10毫升细胞培养液，37摄氏度孵育90分钟。
3) 加入5毫升PBS 洗三次除去MIT-C。
4) 消化和悬浮细胞，每个培养瓶加入2.5×106个细胞，值调pH。旋转和摇晃细胞瓶使细胞分布均匀。成纤维细胞附着，通常需要1-2小时。
7. 胸苷的制备
1) 0.1816克胸苷粉末溶解在10mlPBS得到75 mM的胸苷溶液(原液)。
2) 加入100μL原溶液至3毫升培养基(胸苷最终浓度为2.5mM)。
mESC培养基制备：
1．普通的培养条件， ES(胚胎干)细胞生长于 Mit-C((M0503；Sigma，Germany)，将未分裂小鼠胚胎成纤维细胞(mEF)作为饲养细胞培养于涂有明胶(G2500；Sigma)的组织培养瓶((90025；TPP)。
2．mESC株 RB1 12保持于ES细胞培养基包括Knock-out™培养液(10829-018；Gibco，UK)，辅以15％ES标准的FCS(10439-024；Gibco)，2mM L-谷氨酰胺(15039-027；Gibco)，0.1 mM 2 -巯基乙醇(M7522；Sigma)，1％氨基酸液(11140-035；Gibco)，100 U / mL青霉素和100μg/ mL链霉素(15070-063；Gibco)。
提示：
小鼠胚胎成纤维细胞(mEF)是用来在联合培养提供分泌因子(paracrine element)，细胞外基质(juxtacrine signaling)和细胞接触因子，维持干细胞未分化状态避免失去其全能性。因此，他们也被称为饲养细胞。
继代培养细胞：
1．预热所有试剂
2．将所需试剂吸入培养容器中
3．加入2 ml PBS冲洗细胞瓶两次，轻轻摇动30秒，吸出缓冲液暴露所有媒介含胎牛血清。
4．每个培养瓶加入适量的胰蛋白酶，使之覆盖整个表面。室温孵育约1分钟，快速回来晃动培养瓶4-5次使胰蛋白酶侵入细胞。孵育1分钟后，吸取胰蛋白酶吹打细胞瓶，使连接松散的细胞脱落和团块分解。
5．加入新鲜的，完整的介质使胰蛋白酶失活。一定要在胰酶失活前单细胞。
mESCs：
1．加入2 mM胸苷培养16个小时，使得干细胞达到25-30％汇合。
2．加入1X PBS洗涤除去胸苷，加入新鲜的KO-DMEM完全培养液培养4个小时，释放细胞。细胞达到G2期有丝分裂阶段。
hypotonization
基于 criteria by Fenech标准选择双核细胞适合MNI，只有每个核的核边界分离，才可以获得一个双核细胞。此外，双核细胞的胞质膜必须完整和清楚的与从相邻细胞分离。因此，收集mESCs细胞时胞质膜必须没有损伤。
单个淋巴细胞或细胞株培养的微核试验在收获过程中不需要低渗处理。低渗处理，可能会导致细胞坏死和凋亡，使他们无法检测。另一方面，mESCs有一个大核被较窄的细胞质包围。根据上述所述mESCs进行低渗处理是必要的，不能省略。
收集细胞和制作切片
1．将ES细胞生长于含有4 µg/ml cyt-B的 mEF上，培养14小时。
2．胰酶消化细胞和离心6分钟。
3．重悬细胞沉淀，轻轻拍打管，加入约4 ml低渗溶液。
4．室温下孵育10分钟，再次离心细胞降速细胞，用Carnoy`s fixative (甲醇：冰醋酸3:1)室温固定细胞15分钟，并修复与酷卡诺的固定液沉淀15分钟，在室温下。固定前分散细胞。
5．更换固定液2次。
6．去掉悬浮液，湿玻璃片用乙醇清洗。
7．空气干燥玻璃片，染色用Hoechst 33258(Calbiochem；382061)，和罗丹明B(Sigma；R6626)。8) 荧光显微镜下检查切片。在我们的研究中，用频率表示每个双核细胞MNI的数量(平均值±SD)。
关键
干燥切片不要超过10分钟，否则细胞和分子形态会改变。应将切片保存于储存在阴凉，干燥，无灰尘的盒子里。
计数
检测1千个双核细胞测量MN的形成，每个样品(治疗和对照)。
暂停点：荧光染色切片可以4ºC存储1个月。
微核检查的标准
MNI形态学特征：原子核更小，具有以下特点：
1．人体淋巴细胞的MNI直径，通常为核平均直径的1/16和1/3，这到BN细胞核面积1/256和1/9。
2．MNI不折光，因此，可以很容易地从染色颗粒中区分。
3．MNI不链接或连接到主核上。
4．MNI可能接触但不会与主核重叠。显微核的边缘与核边缘区分。
5．MNI染色强度通常一致，但偶尔染色会更深。(For review see Fenech，2007)。
统计分析：
我们使用t检验，评估基因毒性剂诱导MN形成。
