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采用新一代测序法的宏基因组学研究

2020.3.08

直到不久之前，宏基因组学研究还因为高费用、低流通量以及在应用Sanger-方法克隆步骤中出现的结果不准确而受到限制。而今借助于新一代序列测定方法即可获得宏基因组样品全面的图像。

宏基因组学研究（metagenomics）是指研究一种复杂微生物群体在其生命空间的全部基因信息。研究的主要目的在于刻画存在于样品中的生物体的特征，并确定在其生命空间所起的作用。宏基因组学研究的样品几乎无处不在，例如在人体的各个部位、在土壤中、在极地生命空间例如南极、热的喷泉或者海洋水层之中。

迄今为止，还没有合适的方法能够提供具有重现性的图像来反映有关微生物方面和病毒学方面的生命共性、它们的新陈代谢方式以及它们的适应能力。凭借测序技术的进步，包括引入基因组测序仪FLX-系统，宏基因组学研究项目也呈现井喷式发展。由于流通量的改善以及放弃了歪曲结果的克隆步骤，应用范围业已超越常规的16S-rRNA-基因分析法而得到更为广泛的发展。基于基因测序仪-FLX-数据所发表的大量论文，诸如研究关于微生物的多样性、关于生物体的确定构型、或关于病毒性病源体的证实，都说明了这一研究领域之广阔。这种基因测序仪FLX-系统非常适合宏基因组学研究是有其原因的，因为它的长读出宽度能够保证高度的专属性，这对于将测序结果与DNA-或者蛋白质数据库进行比较从而获得明确的类别检测和基因确证来说是非常必要的。

环境中微生物的多样性

宏基因组学研究是出于各种各样的原因来进行的。比如可以是针对在其生命空间存在的生物体的瞬间摄录，针对一种微生物在其生命空间新陈代谢作用的特性刻画，或者是针对微生物群体对于改变其生命空间条件的反应分析。

近期报道了关于存在于海洋中的具有固氮作用的蓝细菌（UCYN）的功能研究。早期的论文曾经指出，存在有一种自身种系发生的组合，针对其固氮酶基因（UCYN-A）主要是在白天而不是晚上进行实验。这一反应对于蓝细菌而言迄今尚未见诸报道。由于未能培养出物种，这种传统式的研究受到很大的限制。借助于流动细胞仪的分类方法，按照其16S r RNA采用具GS-FLX-钛系统（读取宽度400bp）的Shotgun 序列测定法，对一海水样品中的微生物建立了基因图书馆，能够十倍地覆盖从2 ~3 Mb庞大的UCYN-A基因组。

借助BLAST分析法和根据读数的组成，发现总体固氮酶的簇位于一个重叠群上。对于产生氧气的光子系统II或者对于固碳负责的基因序列则未出现。这一结果是对于游离生存、非光致变色生存的蓝细胞的首次报道。这种在海洋中广泛分布的物种并不进行光合作用、不产生氧气的现象，可以帮助我们理解碳和氮的循环、光合作用的演变以及固氮过程。这种鉴定结果可能对于建立气候变化的模型产生作用，因为氮气对于海洋从大气中吸收碳的能力可能发生影响，这正是我们在理解生物圈时所涉及的中心问题。

图2. 基因组测序仪 FLX 系统可以借助高级的读数宽度很好地用于宏基因组学研究。

人体中微生物的多样性

当前宏基因组学研究最为广泛的应用领域就是描述微生物的活性群体在人体中展示的特性。

人类的身体与这些微生物的交互反应有着依赖关系，它们起着不同的作用，例如在消化和免疫方面的作用。涉及项目计划Microbiom-Initiative的主要目的在于回答这样一个问题：是否在人体的某个特定的生命空间存在有一种可以确证的“核心微生物”，它们具有与全体或大部分人体相同的有机组成或基因。在一份实际研究中，涉及到将人体内的微生物生命群体通过对成年的单卵和双卵双胞胎以及他们母亲的大便的DNA序列测定来加以研究。所有样品均未出现超出0.5%部分的种系。即使是对那些具有代表性的种系而言，在所研究的大肠细菌中所占的份量也是变动的。这一结果反驳了关于存在于共同细菌群体基础上的所谓“核心微生物”的假设。然而通过将所得到的测序数据与功能数据库进行比较，却发现了在所有样品中都有共同的基因功能组和新陈代谢路径。这一结果表明，相同的新陈代谢功能可以由不同种类的细菌所承担。这一研究还清楚说明了在进行宏基因组学研究时，具有长的读数宽度对于测序中物种的排定具有很大的价值。研究者比较了不同长度的读数与GS-FLX-钛系列具有400bp长的读数，结果发现命中率与命中质量均随着增高的读数宽度而明显提高。

宏基因组学研究在从受传染的病人样品中发现，病毒性致病细菌的工作中也显示出很高的效能。在由杂志 New England Journal of Medicine以及 Science所发表的两篇研究论文中，采用了基因测序仪FLX-系统的高通量测序来确证一种通过器官移植引发的新的沙粒病毒（Arenavirus），并确证发生在美国的蜂群死亡的潜在诱因。另一篇研究采用了相同的宏基因组测序法来确证一种新的埃博拉病毒（Ebolavirus），该病毒是2007年11月引发乌干达大规模出血热传染病的元凶。美国疾控中心的研究者曾经收到来自乌干达嫌疑疫区的29份需要立即进行分析的血样，采用了高灵敏度的Real-Time-RT-PCR检测方法，该方法曾经被成功地用来对来自扎伊尔和苏丹地区所有已知的埃博拉病毒和马尔堡病毒进行专属性鉴定的方法，但是却没有发现受到这种埃博拉病毒实际感染的任何证明。采用基因测序仪FLX系统并运用在宏基因组学研究中建立的方法，对从病人血清中离析出来的RNA进行高通量测序，从而得到了有关一种新的病毒完整序列的第一个版本。对该结果的分析表明，这种新发现的病毒与那些已知的四种埃博拉病毒的类别并不相同，其下一代变体在核苷酸排序上显示出32%的偏离。这种新发现的物种因瘟疫爆发地区而命名为埃博拉病毒，它可能是一种科特迪瓦埃博拉病毒的远亲。这种与已知物种之间强烈的差别显示出这类病毒在其抗原性和病原体方面的明显差异。这些研究成果将会在开发监测出血热传染病的医药制剂以及在开发这种疾病的有效治疗手段上发挥重要作用。

宏基因转录组研究

宏基因组学研究扩大了人们对在环境中的基因表达的认识。在宏基因转录组领域中研究工作的增加，在很大程度上应该归功于借助基因组测序仪 FLX系统对微生物活性群体的cDNA进行测序。宏基因转录组研究的魅力在于，可以对一种微生物的活性群体在环境条件改变时的反应进行实时观察。一种新的研究涉及到应用宏基因组学研究和宏基因组学分析来研究海洋表层中微生物活性群体的基因表达。目前人类已经找到了在光合作用、固碳和吸纳氮气中起作用的基因，即那些在新陈代谢路径和在公海中常有的基因。研究中所发现的50% 的基因都是在宏基因组中迄今尚未发现的基因类别。

借助于基因组测序仪 FLX系统可以获得有关基因组样品广泛的图像。无需克隆步骤即可进行高通量测序，而且可以提供进行微生物多样性和微生物活性群体功能分析时所必需的较长的读数宽度。

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周锦帆