文章导读

众所周知，运动可以降低心血管疾病的发生概率。目前已有的研究报道主要集中在肌肉因子方面，因为它具有旁分泌和内分泌作用，能够协调运动的多系统效应。然而，运动对心脏保护作用的潜在机制目前尚未可知。第四军医大学高峰、王立锋科研团队的最新研究成果表明，长期运动衍生的循环外泌体能够传递心脏保护信号，并鉴定出外泌体miR-342-5p是一种新的心脏保护性运动因子，能够对抗大鼠心肌缺血和再灌注（MI/R）引起的损伤。

发表期刊：Circulation Research

影响因子：15.211

实验方法：miRNA测序

实验材料：长期运动的人和大鼠的血浆（实验组），不运动的人和大鼠的血浆（对照组）

文章内容

1.运动对血浆外泌体数量无影响

本篇文章作者首先收集了运动和久坐的大鼠的血浆，从中分离出外泌体，运动大鼠血浆中外泌体为实验组(exe-exo)，久坐大鼠血浆中外泌体为对照组(sed-exo)（图1A），对外泌体进行镜检后（图1B），又检测了两组的外泌体蛋白，结果显示两组间外泌体的量并没有显著差异（图1C），且NTA分析也显示，两组的粒径分布和血浆浓度没有显著性差异（图1D和E）。然后作者用pkh26标记的外泌体和心肌细胞共培养，观察到外泌体在孵育6小时后被心肌细胞内化(图1F)。

图1. 运动和久坐大鼠的外泌体数量无差异；外泌体能被心肌细胞内化

那么问题来了，上述两种情况在人体中是否也存在呢？

于是作者对人做了相同的检测。运动员血浆外泌体为实验组(Row-exo)和普通人的血浆外泌体为对照组(Con-exo)，结果与大鼠一致(图2K和L)。此外，作者还发现将运动员的外泌体和人的心肌细胞共培养后，可以降低细胞凋亡(图2M)，同时释放血清乳酸脱氢酶LDH(图2O)，并能增加心肌细胞活力(图2N)。

图2. 运动员和普通人的外泌体数量也无差异；外泌体也能被心肌细胞内化

2.运动分泌外泌体（exe-exo）对MI/R损伤有心肌保护作用

首先作者对两组大鼠进行心肌缺血30 分钟，再灌注24小时的损伤破坏，发现与久坐对照组(sed)相比，运动组(exe)大鼠心肌梗死面积减少，LDH降低，表明运动对MI/R损伤有明显的心肌保护作用。

为研究运动分泌的外泌体对心肌保护的作用，作者从两组大鼠的等体积血浆中分离出外泌体，并在MI/R损伤前的48小时，将携带pkh26标记的外泌体注射进正常大鼠心肌。接着对大鼠进行MI/R损伤，24小时后发现，与注射sed-exo的大鼠相比，注射exe-exo的大鼠心脏梗死面积显著减小(图3A)，同时伴有LDH降低。此外，作者还发现注射exe-exo的大鼠心脏功能得到改善，如MI/R后保留射血分数和分数缩短4周（图3F-H）。综上，exe-exo对MI/R损伤具有心肌保护作用。

图3. Exe-exo能减少MI/R损伤导致的心肌梗死面积，改善心脏功能

3.miR-342-5p是exe-exo中诱导心脏保护的关键成分

为了探讨miRNA在外泌体诱导的心脏保护中发挥作用的可能性，作者分别对两组大鼠外泌体中的miRNA进行了高通量测序（云序可以提供此服务）。共检测到14个差异表达的miRNAs(图4A)，经q-PCR分析进一步验证后，确定12个差异表达的miRNAs，其中11个表达上调(图4B)。接着作者用缺氧/复氧（H/R）模型研究这11种上调的miRNAs如何影响心肌细胞的功能。发现miR-342-5p能显著降低H/R作用下心肌细胞的凋亡，降低LDH的释放，提高细胞活力(图4C-E)。

为了更好地了解外泌体miR-342-5p的功能，作者又检测了血浆外泌体处理的心肌细胞和心脏中miR-342-5p及其前体的水平。心肌细胞经exe-exo孵育和心脏注射48小时后，其中的miR-342-5p水平显著升高(图4G)，而前体m iR-342-5p水平无明显变化，表明exe-exo将miR-342-5p传递给心肌细胞或心脏。此外，抑制miR-342-5p可以明显减弱运动型血浆外泌体对心脏的保护作用(图4H-J)。这些结果表明miR-342-5p在外泌体诱导的心脏保护中起着关键的作用。

那长期运动是否会导致人体外泌体中miR-342-5p的差异表达呢？

于是作者检测了运动员训练前后血浆外泌体中的miR-342-5p含量，发现训练后它的表达量比未受训的时候提高了1.8倍(图4F)。

图4. miR-342-5p在exe-exo提供的心脏保护中起关键作用

4.miR-342-5p通过靶向结合心肌细胞中的Caspase 9和Jnk2发挥抗凋亡作用

为进一步研究miR-342-5p的作用机制，作者预测了miR-342-5p的靶基因，发现Caspase3、Caspase9和Jnk2能参与MI/R损伤和凋亡途径(图5A)。接着作者又发现增加miR-342-5p后，可以显著降低Caspase9和Jnk2的蛋白水平，反之亦然，但没有观察到Caspase3基因表达的显著改变(图5B)。接着作者用荧光素酶进一步研究了Caspase9和Jnk2两个基因与miR-342-5p的结合位点(图5C)。此外，exe-exo孵育可以显著抑制H/R诱导的心肌细胞裂解-Caspase3、裂解-Caspase9和磷酸(P)-Jnk2的表达(图5D)。综上，这些数据表明miR-342-5p通过靶向结合Caspase9和Jnk2，在心肌细胞中发挥抗凋亡作用。

图5. miR-342-5p通过结合心肌细胞中的Caspase 9和Jnk2发挥抗凋亡作用

5.miR-342-5p通过靶向结合Ppm1f增强心肌细胞中AKT的磷酸化

生存信号AKT和ERK 1/2已被证实为心脏保护的关键分子。miR-342-5p可以上调心肌细胞中AKT的磷酸化，而ERK 1/2的磷酸化水平没有明显变化(图6A)；在H/R心肌细胞中观察到类似的现象(图6B-D)。这些结果表明，miR-342-5p能激活心肌细胞的生存信号AKT。有趣的是，作者发现Ppm1f是miR-342-5p的潜在靶点，这是生信分析预测的唯一磷酸酶（图6E）。如图6F所示，miR-342-5p可以减少Ppm1f蛋白水平，反之亦然。荧光素酶报告分析进一步证实miR-342-5p可以直接结合Ppm1f的3'UTR区(图6G)。值得注意的是，下调Ppm1f蛋白表达不仅显著提高AKT的磷酸化水平(图6H-I)，还可以降低H/R诱导的心肌细胞凋亡(图6J)，这暗示AKT磷酸化水平升高可能在心肌保护中发挥作用。