原位分子杂交和免疫组化SP法对PTEN的检测

【摘要]目的：
研究原位分子杂交和免疫组化sP法检测PTEN mRNA及其蛋白在HCC中的表述隋况。

方法：56例肝细胞肝癌组织、17例肝硬化组织手术切除标本，经40g／L福尔马林固定，4 m厚连续切片，HE染色，病理诊断证实。

结果：HCC组织中，PTENmRNA~蛋白的阳性表达率分别为62.5％和71.4％。17例肝硬化

组织中的阳性表达率分别为88．2％和94．1％。21例癌旁组织中的阳性率分别为90.5％和100％。HCC与肝硬化组织和癌旁肝组织中PTEN  mRNA及其蛋白的表达具有显著性差异(P<005)。

结论:HCC组织中存在较高比例PTEN mRNA和蛋白表达缺失，且恶性程度最高的Hcc组织中，PTENmRNA和蛋白的阳性表达率最低。

PTEN(phosphatase and tensin homologuedeleted on chromosome ten)基因是1997年发现的一种新的肿瘤抑制基因。它在很多种肿瘤中存在着突变和缺失，与肿瘤的发生密切相关。PTEN具有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶双重活性，是目前为止发现的第一个具有脂质磷酸酶活性的抑癌基因。PTEN的蛋白磷酸酶活性具有抑制细胞侵袭的作用；PTEN的脂质磷酸酶活性具有抑制细胞周期进展和诱导细胞凋亡的作用。肝细胞肝癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是常见的恶性肿瘤之一叫。HCC的发生是一个十分复杂和多步骤的过程，其中可能有多种抑癌基因的改变。因此，对抑癌基因的深入探讨，无论对HCC发病机理的阐明，还是对HCC的预防和治疤都具有重要的意义。

1研究对象和方法

2007-2008年56例肝细胞肝癌组织、17例肝硬化组织均为湖南省肿瘤医院病理科手术切除标本，经40g／L福尔马林固定，4“m厚连续切片，HE染色，病理诊断证实。HCc的分级按照WHO的标准分为高分化(I级)7例，中分化(II级)28例，低分化(II级)21例。21例带有癌旁肝组织，其中肝硬化11例，慢性活动性肝炎5例，慢性迁延性肝炎5例。原位杂交：1)切片常规脱蜡至水，3％H O封闭内源性过氧化物酶，室温作用10min；2)蒸馏水洗3X5min。3)3％柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶，37~C消化30min，充分暴露mRNA核酸片段。4)0．5M，pH7．4的PBS缓冲液振洗3×5arin。5)滴加阻断液，40C作用2h，以阻止非特异性的杂交。倾去，勿洗。6)滴加预杂交液，40~C作用2h。倾去，勿洗。7)滴加杂交液，42E杂交过夜。8)30～37℃水温的2×SSC缓冲液振洗2×15min。9)滴加封闭液，37E30min。倾去，勿洗。lO)滴加抗地高辛抗体碱性磷酸酶复合物，37℃60min。11)o．5M，pH7．4的PBS缓冲液振洗4x5min。12)~o显色液显色，1％盐酸酒精分化，顺序酒精、二甲苯脱水透明，中性树胶封片，以正常肝组织做阳性对照，预杂交液代替杂交液做阴性对照。免疫组织化学SP法：1)切片常规脱蜡至水，30mL·L甲醇一HO液封闭内源性过氧化物酶，室温作用30arin。2)水冲洗，0．01M，pH7．4的PBS缓冲液浸泡10min。3)微波抗原修复：切片置于盛有0．01M，pH6．0的柠檬酸盐缓冲液的卧式缸中，上覆有通气孔的塑料薄膜，在高档加热1-2min，待修复液沸腾后，调至低档继续加热8min。置于室温，使切片自然冷却。4)0．01M，pH7．4的PBS缓冲液振洗3×5rain。5)正常羊血清室温封闭30min。倾去，勿洗。6)滴加1：100的兔抗PTEN多克隆抗体，4℃过夜。7)0．01M，pH7．4的PBS缓冲液振洗3x5min。8)滴加生物素标记的羊抗兔IgG，37℃作用标记的链酶卵白素，37℃作用30min。11)o．01M，pH7．4的PBS缓冲液振洗3x5min。12)DAB显色，苏木素复染，l％盐酸酒精分化，顺序酒精、二甲苯脱水透明，中性树胶封片，光镜下观察。以正常肝组织

做阳性对照，0．01M，pH7．4的PBS代替一抗做阴性对照。结果判定及统计学分析：凡胞质中出现明显的淡蓝色颗粒(原位分子杂交)、棕黄色颗粒(免疫组织化为PTEN阳性细胞。在肝组织中，根据阳性细胞与全部细胞的比例分为：阴性：无阳性瘤细胞，阳性(+)：阳性细胞／J、于25％阳性(++)：阳性细胞占25％～5O％l阳性(+++)：阳性细胞大于5&／o。统计学分析用Sf 10．O统计学软件进行统计分析。两样本构成比采用检验。统计学显著陛差~gNP<O．05。

2结果

2．1原位杂交PTEN

mRNA定位于胞质，阳性反应产物呈淡蓝色颗粒，PTEN mRNA阳性细胞呈弥漫性分布。3例正常肝组织中PTEN mRNA的表达均为阳性；17例肝硬化组织中，PTENmRNA表达阳性率为88．2％(15／17)，见图1；21例癌旁肝组织中，PTEN mRNA阳性表达3,g~j90．5％(19／21)，见图2；而56例HCC组织中PTEN mRNA表达的阳性率为62．5％(35／56)，见图3。PTENmRNA在癌旁肝组织及肝硬化组织中的表达明显高于HCC组织(P<0．05，表1)。56例HCC组织中，I和II级PTEN mRNA表达明显高于Ⅲ级(P<O．05，表2)，而在I与II级之间，则无明显差异。

2．2免疫组织化学结果

PTEN蛋白主要定位于胞质，阳性反应产物呈棕色或棕黄色颗粒，弥漫性分布。3例正常肝组织中PTEN蛋白的表达均为强阳性(+++)；肝硬化组织中PTEN蛋白表达阳性率为94．1％(16／17)，主要为强阳性表达；21例癌旁肝组织均为强阳性表达：而56例HCC组织中PTEN蛋白表达的阳性率为71．4％(40／56)(表3)，免疫反应强弱不等，一些标本中，阳性信号较弱。癌旁组织与肝硬化组织中，PTEN的阳性表达率明显高于HCC组织(P<0．O1)。在6例HCC组织中，I、II级PTEN蛋白表达阳性率明显高于III级(尸<0．05，表4)，而在I与II级之间，则无明显差异。另#hi、II级PTEN蛋白的阳性表达强度明显高于III级，多为++～+++，而III级组织中，PTEN染色多为弱阳性或阴性表达。

3讨论

本研究应用原位杂交技术和免疫组织化学技术，对56例HeC组织和17例肝硬化组织及3例正常的肝组织进行了PTENmRNA和PTEN蛋白的检测。在所有3例正常肝组织中，PTEN mRNA和PTEN蛋白均呈阳性表达。在17例肝硬化组织中，PTEN mRNA和PTEN蛋白表达均呈不同强度的阳性表达，阳性率分别为88．2％(15／17)和94．1％(16／l7)。56例HCC组织中，PTEN mRNA和PTEN蛋白的阳性表达率分别为62．5％和71．4‰而2l例癌旁组织中，PTEN mRNA和PTEN蛋白的阳性表达率分别为90．5％(19／21)30min。9)0．01M，pH7．4的PBS缓冲液振洗3X5arin。10)滴加辣根酶和100％。统计学分析表明，PTEN mRNA和PTEN蛋白在癌旁和肝硬化组织中的表达与其在HCC组织中的表达具有显著性差异(P<0．05)。这表明，PTENmRNA和PTEN蛋白在HCC的发生发展中存在着缺失，提示其有可能在HCC的发生发展过程中起到一定的作用。到目前为止，关于PTEN基因在HCC组织和细胞中的研究也只是局限于对基因突变和缺失的研究，对于PTENmRNA及其蛋白在肝癌组织中的表达情况，却很少有报道。本文的研究结果表明，PTEN在mRNA和蛋白水平的表达缺失在恶性程度高的HCC组织中存在着相当高的比例，有可能~_PTEN基因在HCC中失活的主要方式之一。因此，深刻阐明PTEN基因在人体正常组织中的作用及其作用机制，对明确肝细胞肝癌的发病机制，采取相应有效的基因治疗方法具有重大的意义。

4结论

PTEN mRNA及其蛋白都主要定位于胞质中。它们在癌旁组织和肝硬化组织中的表达都明显高于HCC组织<0．o5)。HCC组织中PTENmRNA及其蛋白的表达与HHCC的分化程度呈正相关。HCC的分化程度越高，PTEN mRNA及其蛋白的表达率越高。提示，PTEN基因在肝癌的发生发展中可能起到一定的作用。

（当代医学 王劲）