方法

诱饵-LexA 融合蛋白的构建

1.将编码诱饵蛋白的靶 DNA 克隆到 LexA 融合载体（如，pMW101 或 pMW103) 的多聚接头处，以合成一种框架内的 LexA 融合基因。确定诱饵序列的羧基端存在翻译终止序列。形成的质粒作为 pBait。

2. 采用下列 LexA 融合基因和报道质粒的组合，建立一系列 EGY48 lexAop-LEU2 选择的转化酵母菌：

a.pBait+pMW112(活化测定）

b.pSH17-4+pMW112(活化的阳性对照）

c.pRFHMl+PMW112(活化的阴性对照）

d.pBait+pJK101(抑制/DNA 结合测定）

e.pRFHMl+pJK101(抑制的阳性对照）

f.pJK101单独（抑制的阴性对照）

每种质粒功能的描述，请见表 18-1 和 18-2。

3. 将每种转化混合物铺在适宜的选择性缺陷板上:CM(Glu)-Ura-His(针对质粒组合 a~e) 或 CM(Glu)-Ura(针对质粒组合 f)。将培养板在 37°C 培养 2~3d 以选择含有质粒的转化酵母克隆。

如果克隆在 3~4d 内没有出现，或只有很少量的克隆（<20), 则应重新转化。

4. 制备转化子的母板，从中可按步骤 5~9 描述的那样，对具有 lacZ 和 LEU2 报道子活化表型的特异性克隆进行分析。

活化和抑制活性的鉴定：X-gal 和 Leu2 表型的分析

步骤 5~9 用于测试诱饵-LexA 融合蛋白质的转录激活性，并证实诱饵的融合物不影响 DNA 结合活性（抑制分析的图示请见图 18-9)。对步骤 2 中转化的每种质粒组合，挑选几种单个克隆做分析。这对于某些诱饵的构建非常重要，因为蛋白质表达水平在不同克隆中会有变化，正如活化两种报道子转录激活的表观能力有变化一祥。在第一阶段结束处的替代方案中，给出了一种替代步骤 5~8 的、通过氯仿交叠分析来测试活化的方法。

5. 从 a~f 的每个转化（取自步骤 2) 中，用无菌的平头牙签挑选约 8 个克隆。用干净的牙签触及克隆以挑取细胞，使它们在新鲜的 CM(Glu)-Ura-His 或 CM(Glu)-Ura 板上的小格内成为 lcm 长的线。通常可在一个板上形成多达 60~80 条线。将平板在 30°C 孵育过夜。

6.第二天，从两个母板中再划线到下列每个板上：

转化 a~f: 划线到 CM(Glu,X-gal)-Ura 和 CM(Gal，X-gal)-Ura 上

转化 a~c: 划线到 CM(Glu)-Ura-His-Leu 和 CM(Gal)-Ura-His-Leu 上

7. 在 30°C 将平板孵育到 4d。

8. 对抑制和激活性进行分析；

a. 对于抑制活性，在划线接菌约 12~24 h 时观察 X-gal 表型。

b. 对于激活性，在划线接菌 18 h 到 72 h 之间观察 X-gal 表型。

c. 在 48 h 到 96 h 之间观察 Leu2 表型。在表 18-7 中给出了具有良好表现的诱饵所应得的预期结果，并总结如下。

（1）最好在接种到 CM(Gal,X-gal)-Ural2~24 h, 应当能看出 d+e 转化比 f 的颜色浅。

在接种到 CM(Glu，X-gal)-Ura 48 h,b 转化应当是亮蓝色,c 应当是白色，而 a 应当是白或很淡的蓝色。

（2）在接种后 48 h, 在 CM(Glu)-Ura-His-Leu 或 CM(Gal)-Ura-His-Leu 上，b 转化应当同在 CM(Glu)-Ura-His 母板上一样很好生长，而 a 和 c 应当不生长。

（3）最理想的是,a 转化在接种后 96 h 内仍没有明显的生长。

9.基于抑制和激活分析的结果，选择适当的候选克隆。

检测诱饵蛋白质表达

10. 在母板上，标记要分析蛋白质表达的克隆。用已证实适宜表达诱饵的克隆作为基础菌培养，供文库转化用（在第二阶段中）。

11. 对每个新的诱饵构建，至少分析两个初级转化子。还要包括两个作为蛋白质表达阳性对照的转化子（如 pRFHMI)。

a. 用无菌牙签从 CM(Glu)-Ura-His 母板上挑取克隆，于 CM(Glu)-Ura His 液体培养基中生长。如果带手套，牙签可落入培养管并留在那里，不用担心污染。

b. 在滚筒或其他摇动仪器上 30°C 培养过夜。

c. 早晨，将达饱和的培养液稀释到含 3~5 ml CM(Glu)-Ura-His 的新培养管中，使初始密度 OD600 约为 0.15。30°C 培养 4~6 h, 直到光密度大约增大两倍（OD600 约 0.45~0.7)。

12. 转移 1.5 ml 培养液到一个微量离心管中，在离心机上以最大速度离心细胞 3~5 min。可见沉淀的体积应为 2~5ul。小心倾去或吸除上清。

一些（尽管不是所有）LexA 融合蛋白随生长静止相启动，表现出可检测的蛋白质水平急剧增加。因而，不需要为了期望増加分析蛋白的产率而使培养进行到饱和。

如果预期要进行一轮以上的分析，在此阶段冰冻双份样品可能会有好处。

13. 加入 50ul 的 2XSDS 凝胶加样缓冲液到离心管中，快速震荡离心管以悬浮沉淀。立即将离心管放在干冰上或干冰/乙醇浴中。

样品或即刻用于分析，或在-70°C 冰冻，这样至少可以保持稳定 4~6 个月。

14. 将样品从干冰或-70°C 直接转到 100°C, 并煮沸 5 min。

设定到 100°C 的 PCR 仅最方便，当然也可用水浴或加热。

15. 将样品在冰上冷却并在离心机上以最大速度离心 5~30s 以沉淀大的细胞碎片。加 20~50ul 样品到 SDS 聚丙烯酰胺凝胶的每个泳道中。

16. 电泳并分析产物以确定预期大小的诱饵蛋白是否以合理的水平表达。

17. 为防止可能出现的问题，通过免疫印迹来分析含 LexA 融合的诱饵的酵母裂解液（请见这一步的注解)。

免疫印迹可按附录 8 描述的进行。LexA 融含物可用计对融合域的抗体来检如果没有，也可用抗 LexA 的抗体替代。

确定一种诱饵蛋白的重要一步是直接分析诱饵是否可被检测到，以及诱饵大小是否正确。在多数情况下，上述两项都是正确的。然而，一些蛋白质（特别是融合域在约 60~80kDa 或更大时）或者合成水平很低，或者在翻译后被蛋白酶剪断。这两种结果都可能导致在文库筛选中出现问題。低水平表达以及在转录活化分析中无表观活性的蛋白质, 可在亮氨酸选择下上调到较高水平，然后突然显示转录活化的高背景。在蛋白质由于发生蛋白质水解而剪断时, 对于仅与较大诱饵的氨基端融合的 LexA 来说，筛选仍然可以进行。

第二阶段  筛选一个相互作用子

材料

缓冲液和溶液

将贮存液稀释至适当的浓度

二甲基亚砜（DMSO)

乙醇

可选择，请参见步骤 9。

冻存转化体用的无菌甘油溶液

65% 无菌甘油

0.1mol/LMgS04

25 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)

TE(pH7.5)（无菌）

TE(pH7.5)，含 0.1mol/L 乙酸锂

TE(pH7.5), 含 40%PEG4000 和 0.1mol/L 乙酸锂（无菌）

核酸和寡聚核苷酸

载体 DNA

剪切处理的鲑精 DNA 为典型的常用载体。髙质量的 DNA 是非常重要的。使用低质量的制品可能降低 1~2 个数量级的转化频率。生产髙质量鲑精 DNA 的简便方法请参见 Schiestl 和 Gietz(1998) 的方法和第 6 章方案 10, 也可选择许多公司出售的这种商品。

相互作用筛选文库

培养基

CM 选择培养基

利用表 18-3 估计所需培养基的量，根据表 18-8 制备所需的选择培养

无氨基酸的酵母 (YNB) 分含或不含硫酸铵两类，均有销售。表 18-8 中假定 YNB 中含有硫酸铵。如果酵母氮源包装瓶上说明制备培养基需加 1.7 g/L 酵母氮源，那么它躭不含有硫酸铵，配制时每升培养基中应加入 5 g 硫酸铵。

酵母选择 X-gal 培养基

1. 按照表 18-8 在 900 ml 水中制备基础培养基，高压灭菌后冷却至 55°C。

2. 在另一个瓶于中，将 7 g 磷酸氢二钠和 3 g 磷酸二氢钠溶于 100 ml 蒸馏水中，高压灭菌。

3. 将两种髙压灭菌溶液混合在一起，加入 0.8 ml 浓度为 100 mg/ml 的 X-gal(格于 N,N-二甲基甲酰胺), 铺制平板。

离心机和转子

Sorvall GSA 转子或等同物

Sorall RT6000 离心机和 H1000B 转子或等同物

专用设备

选择培养基用培养极（24 cmX24 cm)(见表 18-3)

这些培养板非常昂贵，但是可以重复使用很多次（见步骤 9)。

Falcon 管（50 ml，无菌）

玻璃珠（直径 0.45 mm, 无菌；Sigma)

可选，请见步骤 9。

加热块，预设至 42°C

微量滴定板（96 孔）

可进，请参见步骤 21。

多道移液器或接种多支管/蛙形器（例如 Dankar Scientific)

可选，请参见步骤 21。

用于多菌落转移的蛙形器可以购买或自己制造也很容易；蛙形器的所有辐条都有一个平坦的表面且辐条末端保持水平是很重要的。蛙形器可以通过高压或乙醇灼烧来灭菌。

载体和细菌菌株或酵母菌株

携带表达诱饵蛋白质和 lexAop/lacZ 报道子的载体的酿酒酵母候选菌株（来自第—阶段）。